外來(lái)入侵植物紫莖澤蘭冷馴化相關(guān)基因ICE1的克隆.pdf

1、紫莖澤蘭（Eupatorium adenophorum Spreng.）原產(chǎn)北美的熱帶及南亞熱帶地區(qū)，但其在入侵到中國(guó)的過(guò)程中逐漸產(chǎn)生了對(duì)低溫的生理性適應(yīng)性分化，有進(jìn)一步向北擴(kuò)張的趨勢(shì)。這可能是其遺傳基因的適應(yīng)性分化所決定的。前期在對(duì)我國(guó)不同地理種群紫莖澤蘭的研究中發(fā)現(xiàn)，廣西百色（BSG）種群冷害指數(shù)和低溫半致死溫度均為最高，屬于冷敏感種群，而貴州黃果樹(shù)（HGG）種群這兩項(xiàng)指標(biāo)都為最低，屬于耐冷種群。進(jìn)一步對(duì)低溫關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子CBF（C-

2、repeat binding factor）及下游COR（cold responsive）基因的克隆研究發(fā)現(xiàn)，4℃處理下EaCBF和EaCOR基因在耐冷種群（HGG）中的表達(dá)要比冷敏感種群（BSG）中高，但是，這并沒(méi)有闡明什么導(dǎo)致這些基因表達(dá)量的差異。
　　 ICE1（inducer of CBF expression1）是在低溫時(shí)誘導(dǎo)CBF基因家族表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活因子，它在低溫時(shí)能特定地結(jié)合到CBF基因的啟動(dòng)子序列上，誘導(dǎo)CBF

3、基因的表達(dá)，而后CBF結(jié)合到其下游目的基因啟動(dòng)子的CRT/DRE序列上，誘導(dǎo)COR基因的表達(dá)，進(jìn)而提高植株的抗寒性。本文通過(guò)對(duì)紫莖澤蘭EaICE1基因的克隆及表達(dá)量分析，以期闡明造成EaCBF和EaCOR基因表達(dá)差異的原因，進(jìn)而解釋HGG種群耐寒性高的原因。
　　 1.抑制性消減雜交（SSH）技術(shù)篩選不同抗寒種群差異表達(dá)基因
　　 本文以經(jīng)低溫誘導(dǎo)的耐冷種群（HGG）和冷敏感（BSG）種群紫莖澤蘭為實(shí)驗(yàn)材料，采用抑制性消

4、減雜交技術(shù)，首次建立紫莖澤蘭抗寒種群低溫誘導(dǎo)過(guò)程的差減cDNA文庫(kù)，并對(duì)文庫(kù)中的部分重組克隆進(jìn)行了測(cè)序分析，為研究紫莖澤蘭對(duì)低溫的適應(yīng)性分化提供了重要信息。
　　 2.EaCBF上游轉(zhuǎn)錄因子EaICE1基因cDNA序列的克隆及結(jié)構(gòu)分析
　　 運(yùn)用RACE方法從紫莖澤蘭（HGG）葉片中克隆得到全長(zhǎng)1652bp的EaICE1基因cDNA序列，含有1503bp的完整閱讀框，編碼一個(gè)501aa長(zhǎng)的Myc類(lèi)的轉(zhuǎn)錄因子。通過(guò)生物信息

5、學(xué)分析，EaICE1擁有和ICE1一樣的特征結(jié)構(gòu)域（HLH結(jié)構(gòu)域），它在DNA結(jié)合和CBF基因的激活方面扮演重要角色。比較紫莖澤蘭耐寒種群（HGG）與冷敏感種群（BSG）以及兩個(gè)中間種群云南景洪（JHY）和云南大理（DLY）EaICE1氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，在第45aa的位置，HGG種群少了兩個(gè)組氨酸。推測(cè)HGG種群EaICE1基因小片段的缺失可能是低溫環(huán)境對(duì)紫莖澤蘭的一種定向選擇結(jié)果，但是這種缺失所引起的蛋白功能上的差異，以及這種差異對(duì)其耐

6、寒性的影響有待進(jìn)一步研究。
　　 3.紫莖澤蘭不同耐冷種群EaICE1基因表達(dá)情況比較
　　 通過(guò)半定量，Northern雜交和熒光定量實(shí)驗(yàn)方法分析4℃處理?xiàng)l件下紫莖澤蘭不同耐冷種群葉片中EaICE1基因表達(dá)情況，結(jié)果表明：EaICE1為組成型表達(dá)，在未處理前，EaICE1在冷敏感種群（BSG）中的表達(dá)量高于耐冷種群（HGG），但此時(shí)的EaICE1蛋白為不激活狀態(tài)。而低溫誘導(dǎo)后，耐冷種群中EaICE1基因表達(dá)量在0.5h