紫莖澤蘭EaCBF1基因的克隆及其在不同地理種群的遺傳差異分析.pdf

1、紫莖澤蘭是我國(guó)為害最嚴(yán)重的惡性外來(lái)入侵雜草之一,原產(chǎn)于墨西哥至哥斯達(dá)黎加一帶,后作為觀賞植物引入歐洲,目前已廣泛分布于世界30多個(gè)國(guó)家和地區(qū).該草于20世紀(jì)40年代經(jīng)緬甸傳入我國(guó),短短幾十年間已經(jīng)遍布我國(guó)西南地區(qū)6個(gè)省市,并以每年幾十公里的速度向我國(guó)北方地區(qū)擴(kuò)散. 植物在長(zhǎng)期進(jìn)化中普遍形成了可誘導(dǎo)激活的抗逆境潛能.植物響應(yīng)低溫逆境形成了復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,并受多種調(diào)控基因和功能基因的控制,這種信號(hào)互作關(guān)系在先前的研究中已經(jīng)得到證實(shí).

2、紫莖澤蘭作為一種熱帶亞熱帶植物有逐步向溫帶蔓延的趨勢(shì),必然有其特殊的抗寒機(jī)制,這很可能與調(diào)控因子的控制有關(guān).在擬南芥、番茄、棉花等多種植物中發(fā)現(xiàn)的CBF轉(zhuǎn)錄因子是植物應(yīng)答低溫逆境的關(guān)鍵調(diào)控因子之一,一直倍受重視.在綜述了紫莖澤蘭入侵機(jī)制及國(guó)內(nèi)外關(guān)于低溫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子CBF研究進(jìn)展的基礎(chǔ)上,本文從紫莖澤蘭低溫調(diào)控因子CBF的克隆入手,進(jìn)行了了紫莖澤蘭CBF序列分析比對(duì)、誘導(dǎo)表達(dá)分析、種群間遺傳差異及遺傳轉(zhuǎn)化等一系列研究,為從分子層面上解釋紫

3、莖澤蘭低溫適應(yīng)性機(jī)制奠定了基礎(chǔ).主要結(jié)果如下: 1.通過(guò)分析擬南芥、番茄等植物的CBF氨基酸核心區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,以DNA為模板,獲得了4個(gè)同源性在70﹪以上的核心區(qū)片段.根據(jù)已知片段設(shè)計(jì)特異引物,運(yùn)用RACE技術(shù)從低溫誘導(dǎo)下的紫莖澤蘭cDNA中獲得一個(gè)全長(zhǎng)800bp的CBF基因,定名為EaCBF1.生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),該基因編碼一個(gè)由219個(gè)氨基酸組成的蛋白,預(yù)測(cè)分子量為22.4kD.該蛋白具有7個(gè)非連續(xù)氨基酸構(gòu)成的核定位信號(hào),

4、60個(gè)氨基酸組成的保守AP2結(jié)合域,以及一個(gè)3'的酸性轉(zhuǎn)錄激活域.不同植物CBF1基因比對(duì)顯示,EaCBF1與蘋果CBF1基因親緣關(guān)系最近其次是番茄,和葡萄的CBF1最遠(yuǎn). 2.由于CBt 基因家族成員間同源性高且多半為單拷貝基因,我們以EaCBF1為探針通過(guò)Southem雜交確定了紫莖澤蘭基因組內(nèi)至少有4個(gè)CBF家族成員,與核心區(qū)克隆測(cè)序結(jié)果一致. 3.運(yùn)用半定量RT-PCR技術(shù)分析了 EaCBF1 在不同逆境脅迫下的

5、表達(dá)水平.結(jié)果顯示,EaCBF1在低溫下表達(dá)量最高,其次是干旱和外源ABA,而高鹽脅迫也會(huì)誘導(dǎo)該基因的微弱表達(dá).表明各種逆境信號(hào)間有串話現(xiàn)象.為了進(jìn)一步研究EaCBF1的功能,我們構(gòu)建了一個(gè)含有CaMV35S啟動(dòng)子的組成型植物表達(dá)載體,并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將該基因轉(zhuǎn)化到煙草中,已獲得了轉(zhuǎn)基因植株,生理生化檢測(cè)正在進(jìn)行中. 4.應(yīng)用等位基因SNP技術(shù)檢測(cè)了15個(gè)地理種群EaCBF1編碼區(qū)的單核苷酸多態(tài)性.通過(guò)測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn),目前我國(guó)西

6、南幾個(gè)受紫莖澤蘭危害較大的省市所采集的植物樣本的EaCBF1在核苷酸水平上有11個(gè)堿基的差異,而由于密碼子的簡(jiǎn)并性,其氨基酸水平上有3處差異.這些結(jié)果表明該基因的核苷酸序列已經(jīng)形成一定程度的遺傳分化,主要表現(xiàn)在云南、四川及貴州種群相對(duì)于重慶和廣西百色種群具有更高的多態(tài)性.從整體趨勢(shì)看云南種群與四川和貴州種群親緣關(guān)系近,與重慶和廣西種群相對(duì)較遠(yuǎn). 本研究以CBF 低溫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子為對(duì)象從溫度這個(gè)限制物種分布的關(guān)鍵環(huán)境因子入手,分析