Lactococcus lactis有氧呼吸末期乳酸利用酶的鑒定及其調控機制的研究.pdf

1、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，L.lactis）是一種具有重要經濟價值的乳品微生物，廣泛用于多種干酪、酪乳、發(fā)酵黃油的生產中。研究表明L.lactis在添加血紅素的有氧條件下可以進行呼吸代謝，獲得的菌體生長存活性能較比常規(guī)的發(fā)酵代謝都有大幅的提高。L.lactis有氧呼吸代謝中最獨特的一個特征是，當培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗盡時菌體可以將環(huán)境中的乳酸代謝掉同時乙偶姻、聯乙醯、乙酸等風味物質大量積累，菌體生物量也繼續(xù)提高，這

2、些特征對于L.lactis的生產及應用來說是非常有價值的。然而至目前為止，科學界對L.lactis細胞內能夠催化乳酸氧化的酶系以及調控乳酸合成-消耗的機制尚無任何相關報道。因此，本研究的目的就是要探尋L.lactis中催化乳酸利用的酶系并闡明調控乳酸代謝的機制。
　　 本課題分為四大部分。首先用生物信息學的方法初步篩選出可能在L.lactis有氧呼吸末期催化乳酸氧化利用的酶系;然后通過測定在L.lactis有氧呼吸及發(fā)酵培養(yǎng)物粗

3、酶中不同類型酶的活性而初步判斷出哪種類型的酶占優(yōu)勢;繼而在體外表達潛在的利用乳酸的酶并用純化的重組蛋白進一步深入研究其乳酸氧化活性的大小以及調節(jié)其生理活性與乳酸氧化活性的機制;最后，對比發(fā)生乳酸氧化之前和之后的細胞內關鍵代謝物的濃度，以驗證細胞內代謝物的變化是否有利于這種酶在有氧呼吸末期催化乳酸的氧化。
　　 首先利用生物信息學篩選L.lactis中可能具有乳酸氧化活性的酶系。結果表明，非黃素含鐵硫簇的多亞基乳酸脫氫酶LutAB

4、C的同源蛋白編碼基因在L.lactis中普遍存在。由于LutABC蛋白復合物在Bacillus subtilis168中具有L-iLDH(NAD-independent L-lactatedehydrogenase)活性，因此L.lactis中LutABC同源物也可能具有L-iLDH活性。另一種具有L-iLDH活性的酶flavocytochrome b2在L.lactis中有兩種同源蛋白，一種是乳酸氧化酶，一種是Ⅱ型IPP異構酶，但只有

5、Ⅱ型IPP異構酶能夠同時滿足在L.lactis有氧呼吸末期催化乳酸氧化的幾個條件，因此可能具備L-iLDH活性并參與有氧呼吸末期L.lacits對乳酸的利用。除已知L-iLDH及其同源物以外，屬于發(fā)酵型L-nLDH(NAD-dependent L-LDH)的LDHA在L.lactis中也普遍存在并有乳酸氧化活性，因此有可能參與呼吸末期細胞對乳酸的利用。
　　 繪制L.lactis在呼吸及發(fā)酵條件下的生物量和代謝產物的時間曲線，分

6、別在兩種培養(yǎng)方式的指數生長期和穩(wěn)定期收集細胞制備粗酶，測定L-nLDH和L-iLDH活性。結果表明，L.lactis的L-iLDH活性非常微弱，與培養(yǎng)方式及培養(yǎng)時期無關。與此不同的是，L.lactis的L-nLDH活性始終非常顯著，即便在發(fā)生乳酸利用的有氧呼吸穩(wěn)定期也是如此。
　　 利用pQE30Xa載體構建Ⅱ型IPP異構酶編碼基因fni的表達載體，轉化E.coli M15進行表達。SDS-PAGE分析表明重組FNI單亞基分子量

7、為41.17 kDa。光譜掃描結果顯示FNI屬于黃素蛋白。1H NMR分析表明，重組FNI能夠有效催化IPP異構化生成DMAPP，證實純化的重組FNI具有顯著的生物學活性。經nLDH和iLDH活性測定，重組FNI的兩類乳酸氧化活性都非常低，降低酶的添加量或是向反應體系中加入二價金屬離子都會導致活性進一步降低至無法檢測到。
　　 本研究設計了一種新的用于測定nLDH的乳酸氧化活性方法，可以測定呼吸條件下NADH的移除對乳酸氧化活性

8、的影響。用pEASY載體表達生成H2O的NADH氧化酶基因noxE，并用2，4-二硝基苯肼測定添加或不添加NoxE時丙酮酸生成量的變化。經測定，重組NoxE具有顯著的NADH氧化活性。以新的添加有NoxE的反應體系下測定FNI的乳酸氧化活性，活性沒有明顯提高。
　　 參照表達fni基因的程序構建LDHA的編碼基因ldh的表達載體，最終獲得E.coli M15(pREP4，pQELDH)重組菌株。SDS-PAGE分析表明該重組菌株

9、可經誘導表達大小正確的重組蛋白。然而多次測定酶活都檢測不到有明顯的活性。因此有必要重新構建LDHA的表達菌株。
　　 選用6×His標簽位于C端的pEASY載體表達ldh基因。參照表達noxE的程序構建ldh基因的表達載體，獲得重組菌株E.coli Transetta(DE3)(pEASY-LDH)。SDS-PAGE分析表明重組LDHA單亞基分子量為37.24 kDa，大小正確。在不添加FBP情況下，LDHA的丙酮酸還原活性很微

10、弱;當添加1mM的FBP(fructose1，6-bisphosphate)后，丙酮酸還原活性驟然提高了7000多倍。結果表明，利用pEASY載體構建的表達菌株能夠表達具有顯著L-nLDH活性的重組LDHA，這種活性強烈依賴于FBP的激活。
　　 酶動力學研究表明LDHA對正反應底物的親和力以及催化正反應的最大速率都要顯著高于逆反應，因此LDHA傾向于催化丙酮酸還原反應。FBP和磷酸鹽對LDHA活性影響的實驗結果表明，FBP和磷

11、酸鹽對LDHA的活性有顯著的調節(jié)作用。然而二者對兩個方向反應的激活或抑制程度是相同的，因而不會改變反應平衡。結果表明，腺嘌呤核苷酸對LDHA具有抑制作用，ATP對正、逆反應的抑制微弱而且程度相似。ADP的抑制作用明顯，屬于競爭性抑制類型。整體而言，ADP對逆反應有相對抑制作用，然而這種抑制程度強烈依賴于NADH、NAD、ADP之間的濃度關系。
　　 實驗證實，NADH/NAD比率對反應平衡影響很大。LDHA的丙酮酸還原活性在很寬

12、泛的NADH/NAD范圍內受到的影響不大。另一方面，逆反應速率只在NADH/NAD比率很低時才顯著。進一步研究發(fā)現，LDHA對丙酮酸的親和性隨著NADH濃度的降低而降低。乳酸對正反應的抑制作用很弱，而丙酮酸對逆反應有著強烈的抑制作用。
　　 利用本研究設計的方法來評估LDHA在NADH可以被移除的條件下乳酸氧化活性的變化。結果表明，在添加NoxE后LDHA的乳酸氧化活性提高了2.84倍。因此在有氧呼吸條件下，LDHA催化乳酸氧化

13、的活性會明顯提高。
　　 細胞內代謝物分析結果表明，胞內ADP的濃度在有氧呼吸指數生長期和穩(wěn)定期始終維持在一個很低的水平，胞內NAD的濃度也基本維持恒定。然而當培養(yǎng)物進入到穩(wěn)定期以后，胞內NADH和丙酮酸的濃度顯著降低。根據上述結果，穩(wěn)定期細胞內關鍵代謝物的濃度利于LDHA催化乳酸氧化反應。
　　 本研究首次證實發(fā)酵型nLDH負責催化L.lactis有氧呼吸末期乳酸的氧化并提出發(fā)生乳酸氧化的先決條件以及相關的轉運和代謝途