骨肉瘤中缺氧誘導HIF-1α調(diào)控乳酸脫氫酶-A的機制研究.pdf

1、目的：
　　明確骨肉瘤細胞缺氧條件下HIF-1α調(diào)控乳酸脫氫酶-A的分子機制及乳酸脫氫酶-A對骨肉瘤細胞惡性生物學行為的影響。
　　方法：
　　1.免疫組化分析18例臨床標本，確認乳酸脫氫酶-A在骨肉瘤患者中的表達情況；
　　2.實時熒光定量PCR檢測分析骨肉瘤細胞系MG63細胞在常氧條與缺氧條件下乳酸脫氫酶-A的表達情況。蛋白印記法檢測骨肉瘤細胞系MG3細胞在常氧條與缺氧條件下乳酸脫氫酶-A及HIF-1蛋白水平

2、的表達情況。
　　3．構(gòu)建含有乳酸脫氫酶-A啟動子區(qū)的螢光素酶報告載體，通過免疫熒光素酶活性實驗檢測MC63細胞缺氧誘導表達的內(nèi)源性HIF-1是否對乳酸脫氫酶-A具有調(diào)控作用，并進一步明確HIF-1對乳酸脫氫酶-A的調(diào)控位點；常氧下轉(zhuǎn)染HIF-1過表達質(zhì)粒，觀察外源性HIF-1的表達對乳酸脫氫酶-A的調(diào)控作用及位點。
　　4．構(gòu)建HIF-1敲除質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染MG63細胞，對比常氧條件與缺氧條件下，敲除HIF-1后是否能有效抑制乳

3、酸脫氫酶-A的表達，從而進一步反正HIF-1對乳酸脫氫酶-A的調(diào)控。
　　5．構(gòu)建乳酸脫氫酶-A敲除質(zhì)粒，缺氧條件下培養(yǎng)MG63細胞，通過細胞劃痕實驗，觀察敲除乳酸脫氫酶-A對 MG63細胞的遷移能力的影響。
　　6．通過細胞活性檢測實驗，檢測缺氧條件下敲除乳酸脫氫酶-A后，MG63細胞的細胞活力及增殖情況。
　　結(jié)果：
　　1.乳酸脫氫酶-A在大多數(shù)骨肉臨床樣本中高表達，在檢測的18例臨床樣本中，4例弱陽性、8

4、呈陽性、6例呈強陽性，陽性率達80％；
　　2.缺氧條件下，RT-PCR檢測MG63細胞中乳酸脫氫酶-A表達明顯上調(diào)，與常氧條件相比較差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)；
　　3.通過熒光素酶報告實驗，我們發(fā)現(xiàn)缺氧條件下HIF-1可誘導乳酸脫氫酶-A的表達，其調(diào)控關系主要通過結(jié)合乳酸脫氫酶-A啟動子區(qū)的缺氧誘導元件-D介導。
　　4.通過RNA干擾技術，缺氧條件下敲除HIF-1α后，明顯的抑制了缺氧對乳酸脫氫酶-A表達

5、的誘導；
　　5.通過劃痕實驗，我們發(fā)現(xiàn)缺氧條件下MG63細胞敲除乳酸脫氫酶-A后，能明顯抑制其遷移能力；
　　6.通過細胞活性實驗檢測，缺氧條件下MG63細胞敲除乳酸脫氫酶-A后，其增殖能力受到一定程度的抑制，與未敲除組比較不具統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論：
　　本研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組織中，腫瘤內(nèi)部常處于缺氧狀態(tài)，缺氧的微環(huán)境下HIF-1表達上調(diào)，并通過與乳酸脫氫酶A啟動子區(qū)的缺氧誘導原件-D結(jié)合激活其表達。同時，我們還