擬毒素遞藥載體的構(gòu)建與表達(dá)及體外活性研究.pdf

1、目前市面上治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)類疾病的藥物，都需要跨越血腦屏障(Blood BrainBarrier, BBB)的障礙，然而，大部分的藥物不能穿越血腦屏障。目前蛋白質(zhì)類藥物因其低毒性，靶向性，高效性而備受關(guān)注。本研究擬模擬霍亂毒素(Cholerla Toxin，CT)的分子結(jié)構(gòu)，構(gòu)建一種腦靶向性的遞藥載體，該遞藥載體將能克服血腦屏障的障礙，高效無創(chuàng)地將藥物輸送入腦部。
　　天然的霍亂毒素由B亞單位(Cholerla Toxin B S

2、ubunit，CTB)和A亞單位(CholerlaToxin A Subunit，CTA)組成。五聚體(CTB)5能夠與神經(jīng)結(jié)苷脂GM1(GangliosidosesGM1)結(jié)合，而A亞單位則“插”在五聚體中間的小孔上。B亞單位通過與粘膜表面的GM1結(jié)合，使得整個CT分子瞄定在粘膜表面上，引導(dǎo)A亞單位經(jīng)由中間小孔，進(jìn)入細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞后，A亞單位迅速被水解為A1與A2部分。A1部分為毒性部分可使得細(xì)胞內(nèi)離子外輸，而威脅生命。A2則為無毒部

3、分，是與(CTB)5“小孔”作用的關(guān)鍵部分。本研究致力于尋找一種方法，構(gòu)建一種類似霍亂毒素結(jié)構(gòu)的遞藥載體，可協(xié)助蛋白質(zhì)藥物的跨血腦屏障運輸，可用EGFP作為示蹤蛋白，(CTB)5可與鼻粘膜上富含的神經(jīng)結(jié)苷脂GM1結(jié)合，引導(dǎo)EGFP-CTA2無創(chuàng)進(jìn)入體內(nèi)。為了提升EGFP-CTA2的跨膜能力，有效將EGFP輸送入大腦內(nèi)，還將一短肽TAT(HIV反式激活因子)與之融合，最終獲得一種新型遞藥載體蛋白“EGFP-CTA2-TAT/(CTB)5”

4、。
　　本研究經(jīng)探索，使用體外組裝獲的方法來獲得目標(biāo)蛋白EGFP-CTA2-TAT/(CTB)5。首先，將CTB克隆到pETduet-1多克隆位點1上，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，條件優(yōu)化為0.75mmol/L IPTG、160r/min、37℃、表達(dá)6h后，可以獲得大量的包涵體蛋白CTB，經(jīng)過洗滌，純化，復(fù)性獲得蛋白(CTB)5。使用本實驗室保存的pET22b-EGFP-CTA2-TAT進(jìn)行上清表達(dá)及純化EGFP-CTA2-TAT，優(yōu)

5、化EGFP-CTA2-TAT誘導(dǎo)表達(dá)條件為0.1mmol/LIPTG,28℃，誘導(dǎo)表達(dá)8h后，可獲得上清EGFP-CTA2-TAT的表達(dá)量最大。經(jīng)NI-NTA純化后得蛋白EGFP-CTA2-TAT。(CTB)5與EGFP-CTA2-TAT經(jīng)過超濾除鹽，按(CTB)5∶EGFP-CTA2-TAT為5∶1的摩爾比混合蛋白，并對混合物經(jīng)酸變性，堿復(fù)性后，利用HPLC和非變性電泳鑒定六聚體蛋白EGFP-CTA2-TAT/(CTB)5的形成。GM