DNA穩(wěn)定銀納米簇的合成及其DNA和腫瘤細胞的免標記檢測研究.pdf

1、金屬納米簇(metal nanoclusters)是一類由數(shù)個到數(shù)十個原子組成，結(jié)構(gòu)介于單金屬原子和納米顆粒之間的金屬納米團簇，它的獨特結(jié)構(gòu)賦予其熒光量子產(chǎn)率高、熒光穩(wěn)定性好等優(yōu)越的熒光性質(zhì)，同時也具有生物毒性低、水溶性好等優(yōu)勢，這些特性使得金屬納米簇作為一類新型免標記熒光材料在熒光分析和熒光成像等領域得到廣泛的關注和研究。其中，利用DNA為模板合成的銀納米簇熒光性質(zhì)優(yōu)良，通過改變DNA序列可產(chǎn)生可見到近紅外區(qū)間熒光發(fā)射帶的不同銀納米簇

2、，引起了科研工作者特別的重視。利用銀納米簇模板DNA本身是核酸的屬性，很多可用來操控核酸的工具酶也可以引入到這種免標記的熒光探針中來?；贒NA分子與不同靶標的特異識別能力(如核酸堿基互補配對結(jié)合，核酸適體與目標物的結(jié)合等)，這種免標記的熒光探針也可用于核酸、離子、小分子、蛋白質(zhì)、甚至細胞的檢測。基于此，本論文以DNA穩(wěn)定的銀納米簇為研究對象，一方面利用其熒光作為信號來源，結(jié)合核酸工具酶放大技術(shù)將其應用于核酸的免標記靈敏檢測;另一方面，

3、通過合成模板序列的優(yōu)化，篩選出一條可高效合成銀納米簇的DNA模板，并通過在DNA模板上延長一段腫瘤細胞的aptamer序列，進一步將其運用于腫瘤細胞的免標記檢測。主要研究內(nèi)容如下:
　　一、基于DNA穩(wěn)定的熒光銀納米簇結(jié)合核酸外切酶Ⅲ輔助的信號放大用于DNA的免標記檢測研究
　　DNA穩(wěn)定的熒光銀納米簇因具備合成簡便、成本低廉、熒光強度大及熒光穩(wěn)定性好等優(yōu)點，常被用于構(gòu)建免標記的熒光分子探針;然而，其合成需要高濃度DNA模板

4、(微摩爾)使得基于銀納米簇的分析方法檢測靈敏度受限。利用銀納米模板是核酸的特性，結(jié)合一些核酸工具酶輔助的信號放大技術(shù)，能夠有效地克服該缺陷。在本工作中，基于銀納米簇對DNA模板構(gòu)型和序列的依賴性及外切酶Ⅲ輔助的信號放大作用，我們發(fā)展了一種免標記、靈敏的核酸檢測方法。在本方法中，我們設計了兩個核酸探針，一個是包含銀納米簇合成模板的3'突出發(fā)夾序列(HP);一個是含有能打開HP的3'突出雙鏈序列(P/HB)。當靶標DNA不存在時，銀納米簇的

5、模板被固定在HP發(fā)夾的莖部，此雙鏈結(jié)構(gòu)不能介導銀納米簇的合成。當靶標DNA存在時，靶標能與P/HB探針結(jié)合形成雙鏈平齊末端，此時外切酶Ⅲ能特異識別該平齊末端并逐漸水解完整的雙鏈部分，同時釋放出靶標DNA和P鏈。釋放的靶標DNA即可進行重復水解循環(huán)。釋放的P鏈可以進入下一個循環(huán)打開HP發(fā)夾結(jié)構(gòu)并形成雙鏈平齊末端，外切酶Ⅲ又能特異識別平齊末端產(chǎn)生新的水解，生成銀納米簇模板DNA(T-DNA)，同時釋放出P繼續(xù)進行該循環(huán)產(chǎn)生更多的T-DNA。

6、最終大量的銀納米簇模板被釋放，該模板能特異介導銀納米簇的合成，從而表現(xiàn)出很強的熒光信號。通過熒光信號的測量即可檢測靶標DNA的含量。該方法操作簡便、成本低廉、無需標記，具有良好的選擇性和靈敏度，為核酸的檢測方法提供一種思路。
　　二、DNA穩(wěn)定的超強熒光銀納米簇的合成及其用于腫瘤細胞的免標記檢測研究
　　DNA穩(wěn)定的熒光銀納米簇對模板DNA序列和構(gòu)型具有高度依賴性，不同的DNA模板制備出的銀納米簇熒光性質(zhì)差別很大，比如熒光強

7、度和光譜位置的變化。銀納米簇也存在一些缺點，如DNA模板需求濃度高，部分序列合成的銀納米簇熒光強度較低且穩(wěn)定性差，因而限制了銀納米簇在檢測方面的靈敏性以及在復雜生物樣品中的應用。為進一步探討DNA模板對銀納米簇合成的影響和擴寬DNA穩(wěn)定的銀納米簇的應用領域，在本工作中我們首先篩選出了一條可以合成超強熒光銀納米簇的DNA模板序列，其熒光強度超過目前已報道的絕大部分以DNA為模板合成的銀納米簇，而且其光學性質(zhì)穩(wěn)定，抗光漂白性能力強。然后，在

8、該模板的序列的基礎上，延伸一段可特異性識別CCRF-CEM細胞的aptamer(sgc8c)，構(gòu)建了一種免標記的熒光探針用于腫瘤細胞的靈敏檢測。通過對比連接aptamer序列前后模板合成的銀納米簇的光譜性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)aptamer的加入并沒有影響模板序列對銀納米簇的合成，之后的細胞實驗也證明銀納米簇模板序列的加入不會影響aptamer對靶細胞的識別效果。因此，該模板序列穩(wěn)定的銀納米簇有望在不同領域作為免標記探針得到更廣泛的應用，同時也有望成