MAPK家族成員在燒傷引起的內(nèi)皮細(xì)胞激活過程中不同作用.pdf

1、研究目的：血管通透性增高和白細(xì)胞黏附是創(chuàng)傷、燒傷、休克和炎癥等許多病理過程中的重要變化，特別在燒傷性休克中對(duì)病情的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸具有重要的影響。由于其發(fā)生機(jī)制一直沒有充分闡明，目前尚未找到防治燒傷血管通透性紊亂的有效措施，因此探索血管通透性增高的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制極為重要。本實(shí)驗(yàn)室過去的工作證明，阻斷G蛋白受體的激酶，Rho激酶，可以阻斷燒傷血清引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)力纖維的形成，并改善燒傷引起的血管通透性增高。我們還發(fā)現(xiàn)PKC、ERK和p38都參

2、與了燒傷引起的內(nèi)皮細(xì)胞肌動(dòng)蛋白重組，尤其是p38α、p38δ發(fā)揮了相對(duì)更重要的作用。為了進(jìn)一步研究p38上游及其下游信號(hào)通路在燒傷引起的內(nèi)皮細(xì)胞功能改變、血管通透性增高以及白細(xì)胞黏附中發(fā)揮的作用，本研究采用分子生物學(xué)和組織學(xué)等手段，在分子水平、細(xì)胞水平觀察正常及燒傷血漿刺激所致的內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白緊密連接蛋白的變化同血管通透性的關(guān)系；觀察p38信號(hào)通路對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子、內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白的調(diào)節(jié)作用：探討ICAM-1表達(dá)調(diào)控的機(jī)制，期待為闡

3、明燒傷內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的機(jī)制提供一定的依據(jù)，為血管通透性紊亂的防治提供新的治療靶點(diǎn)。
　　 研究方法：
　　 1、制備燒傷血漿：用我室方法，將200g-250gSD大鼠給予大于體表1/3面積的燙傷，隨后經(jīng)頸動(dòng)脈取血，離心，保留上清備用；正常大鼠血漿制備采用37℃溫水浸浴30s，余同燒傷大鼠。
　　 2、按照實(shí)驗(yàn)分組，分別用MAPKs的特異性抑制劑和腺病毒載體預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞，然后給予燒傷血漿刺激，觀察抑制MAPKs

4、及其下游通路活化后對(duì)燒傷血漿引起的內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)的影響；
　　 3、用熒光探針標(biāo)記燒傷內(nèi)皮細(xì)胞F-actin、ICAM-1和ZO-1，然后采用激光共聚焦顯微鏡觀察它們的改變和重構(gòu)；
　　 4、用Western blot觀察MAPKs相關(guān)蛋白的活化水平與燒傷引起的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的關(guān)系。
　　 研究結(jié)果：
　　 1、燒傷血清可以有效激活內(nèi)皮細(xì)胞的MAPKs通路。燒傷血清刺激5min后，JNK、p38、ERK的

5、磷酸化水平開始增高。p38的磷酸化水平在10 min時(shí)達(dá)到高峰，ERK的磷酸化水平在15min達(dá)到最高，而JNK的磷酸化水平20min時(shí)達(dá)到峰值。
　　 2、正常內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的F-actin主要環(huán)繞在細(xì)胞周邊，排列緊密圓滑。燒傷血漿刺激1h后的內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞骨架F-actin外周致密帶邊緣變得毛糙不規(guī)整，細(xì)胞中央有散在應(yīng)力纖維形成。而給予p38的抑制劑SB203580或ERK的抑制劑PD98059預(yù)處理30 min，可明顯減少內(nèi)皮

6、細(xì)胞應(yīng)力纖維的形成；但阻斷JNK通路，未見明顯改變。
　　 3、p38的下游激酶MAPKAPK2(MK2)和PRAK都參與了燒傷血漿引起的內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白重組。用腺病毒載體使MK2持續(xù)活化時(shí)，可明顯使肌動(dòng)蛋白重構(gòu)，形成大量的應(yīng)力纖維；持續(xù)活化PRAK也可起到類似作用，但并不明顯。同樣，使用病毒載體抑制MK2的活化時(shí)，可明顯減少燒傷血漿引起的應(yīng)力纖維；阻斷PRAK作用不如阻斷MK2明顯。由此推斷，燒傷時(shí)，MK2與PRAK都參與了p

7、38介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞肌動(dòng)蛋白的重構(gòu)，但MK2的作用可能更加重要。
　　 4、p38介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重構(gòu)，可能是通過MK2和PRAK對(duì)HSP27的磷酸化實(shí)現(xiàn)的。燒傷血清刺激內(nèi)皮細(xì)胞，可明顯增加HSP27的磷酸化水平：用腺病毒載體持續(xù)活化MK2可明顯增加HSP27的磷酸化水平，持續(xù)活化PRAK對(duì)HSP27磷酸化水平的作用不十分明顯；阻斷MK2可明顯抑制燒傷血漿引起的HSP27磷酸化水平的升高，阻斷PRAK也有部分類似作

8、用。而且上述結(jié)果與內(nèi)皮細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架的形態(tài)相對(duì)應(yīng)。
　　 5、阻斷PKC和Rho激酶都可以不同程度的緩解燒傷引起的內(nèi)皮骨架蛋白排列紊亂。使用PKC和Rho的特異性抑制劑，都可以減少燒傷內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)力纖維的形成，抑制Rho激酶的活性還可以降低燒傷血漿引起的p38磷酸化水平。推斷PKC和Rho激酶參與燒傷血漿引起的內(nèi)皮細(xì)胞活化。
　　 6、p38參與燒傷引起的內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接破壞。正常內(nèi)皮細(xì)胞的ZO-1分布在細(xì)胞近內(nèi)膜處，排

9、列緊密，邊緣光滑。燒傷刺激1h后，ZO-1分布呈環(huán)點(diǎn)狀，細(xì)胞輪廓模糊，胞漿內(nèi)彌散有ZO-1蛋白。用SB203580處理30 min后，可以抑制燒傷血漿引起的內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接Z0-1分布的改變，細(xì)胞輪廓清晰，ZO-1仍均勻分布在細(xì)胞周邊；抑制ERK通路沒有保護(hù)作用。
　　 7、正常內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)很少：而在燒傷血漿刺激24h后，ICAM-1表達(dá)明顯增多，而給予JNK的特異性抑制劑預(yù)處理后，明顯抑制了燒傷血漿引起的ICAM-

10、1表達(dá)。提示JNK參與調(diào)控了燒傷引起的內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)，可能在白細(xì)胞黏附以及遷移中發(fā)揮了一定的作用。
　　 結(jié)論：
　　 1、我們發(fā)現(xiàn)在燒傷血漿刺激的內(nèi)皮細(xì)胞，MAPKs被激活；
　　 2、PKC和Rho激酶參與調(diào)節(jié)了燒傷時(shí)人皮膚微靜脈內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)力纖維的形成；
　　 3、p38和ERK參與調(diào)節(jié)了燒傷內(nèi)皮細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的重構(gòu)和應(yīng)力纖維的形成，p38還參與了燒傷內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的破壞過程；