一種r-扁桃酸脫氫酶的酶學(xué)性質(zhì)及其輔因子循環(huán)的研究.pdf

1、S-扁桃酸是合成手性藥物及精細(xì)化工領(lǐng)域的重要中間體，可通過(guò)外消旋扁桃酸經(jīng)手性拆分獲得。生物酶法手性拆分具有立體專一性強(qiáng)、反應(yīng)溫和、耗能少、成本低、對(duì)環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)，手性單一的氧化還原酶常被用來(lái)拆分外消旋化合物。以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)作為輔因子的R-扁桃酸脫氫酶(RMDH)專一催化R-扁桃酸(R-MA)生成苯乙酮酸，可以用來(lái)拆分外消旋扁桃酸獲得手性S-扁桃酸(S-MA)。本研究旨在獲得純化的RMDH，并對(duì)RMDH的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)

2、行研究;同時(shí)，通過(guò)酶偶聯(lián)法實(shí)現(xiàn)RMDH輔因子NAD+的再生，為生產(chǎn)S-MA打下研究基礎(chǔ)。
　　從土壤中篩選得到一株產(chǎn)RMDH的細(xì)菌，通過(guò)16s rDNA序列分析和對(duì)菌體的透射電鏡觀察，該菌株被鑒定為Pseudomonas putida。該菌為桿菌，長(zhǎng)約1.7-2.3μm，寬約0.6-0.9μm，有極生鞭毛。將液體培養(yǎng)獲得的菌體通過(guò)超聲破碎、硫酸銨鹽析、疏水層析提取分離后得到純化倍數(shù)11.0，比活力0.33 U/mg的RMDH。SD

3、S-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示純化后的RMDH為單一條帶，分子量為61 kDa。實(shí)驗(yàn)對(duì)RMDH的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。RMDH在pH7.6-pH9.0酶活力較高，最適pH為8.5;在溫度梯度20℃-40℃酶活力較高，最適溫度為30℃。在最適條件下，RMDH對(duì)R-MA的Km值為2.0×10-2 mM，kcat為0.9 s-1;對(duì)NAD+的Km值為1.8×10-2 mM，kcat為0.9 s-1;對(duì)NADP+的Km值為1.5×10-2 mM，

4、kcat為0.3 s-1。RMDH既可以用NAD+作為輔因子，也可以用NADP+作為輔因子。以NAD+作為輔因子時(shí)，RMDH的催化效率是以NADP+作為輔因子時(shí)的2.5倍。
　　從土壤中篩選得到產(chǎn)NADH脫氫酶的野生菌株E.coli JZW506，發(fā)酵獲得的菌體經(jīng)過(guò)超聲波破碎獲得粗酶，粗酶經(jīng)過(guò)硫酸銨鹽析、DEAE-纖維素離子交換層析分離純化，獲得NADH脫氫酶。NADH脫氫酶在pH5.6-pH8.0酶活力較高，最適pH為7.6;在

5、溫度梯度25℃-60℃酶活力較高，其最適溫度為45℃。在最適條件下，NADH脫氫酶對(duì)NADH的Km值為10.2μM。
　　構(gòu)建以NADH脫氫酶和漆酶雙酶偶聯(lián)系統(tǒng)為基礎(chǔ)的NAD+再生的方法，為NAD+依賴型氧化還原酶的大規(guī)模應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。在NADH脫氫酶與漆酶總酶活1∶1的情況下，雙酶最佳偶聯(lián)溫度為30℃，最佳偶聯(lián)pH為5.6。在此條件下，由0.5 U的NADH脫氫酶與0.5 U的漆酶組成的雙酶系統(tǒng)，以0.1mM的鐵氰化鉀作為電