蜂王漿主蛋白1--3的純化鑒定及在儲(chǔ)存過程中變化.pdf

1、蜂王漿具有許多益于人類健康的生物學(xué)功能，蜂王漿主蛋白(MRJPs)作為蜂王漿中含量最多的特征性成分，已經(jīng)成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)。因此本課題以西方蜜蜂(Apis mellifera)蜂王漿為原料，建立一套逐步分離純化天然狀態(tài)下MRJP1-3的流程，并首次利用高靈敏度的高效液相對分離純化后的單一蛋白進(jìn)行純度鑒定，同時(shí)研究了蜂王漿蛋白在儲(chǔ)存過程中的變化，結(jié)果如下。
　　1.使用疏水色譜柱、尺寸排阻色譜柱和陽離子交換色譜柱三種色譜柱，建立了一

2、套MRJP1-3的純化流程。首先使用Hitrap Butyl-HP疏水色譜柱對蜂王漿粗提液進(jìn)行分離，得到含有MRJP2和MRJP3的穿透組分，和依次被洗脫的MRJP1寡聚體組分和MRJP1單體組分;然后對兩個(gè)MRJP1組分分別使用HiLoad X16/60 Superdex200 pg尺寸排阻色譜柱進(jìn)行純化，得到了MRJP1寡聚體1、MRJP1寡聚體2和MPJP1單體;最后使用Toyopearl GigaCap S-650M陽離子交換色

3、譜柱對來自第一步疏水色譜層析的穿透組分進(jìn)行分離，得到了MRJP2和MRJP3。
　　2.通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)對五個(gè)純化好的單一主蛋白進(jìn)行鑒定，其中MRJP1寡聚體1、MRJP1寡聚體2、MRJP1單體、MRJP2和MRS3的序列覆蓋率分別為:92.13％、76.62％、91.2％、87.39％和64.71％。其中670 kDa蛋白首次被純化并鑒定為MRJP1寡聚體。使用SEC-HPLC對這五個(gè)單一蛋白

4、進(jìn)行了純度鑒定，結(jié)果分別為89.88％、67.79％、99.92％、99.41％和99.97％。
　　3.利用分析超速離心方法，對MRJP1寡聚體進(jìn)行精確的分子量測定，結(jié)果表明MRJP1含有三個(gè)寡聚體，分別是228 kDa的MRJP1寡聚體1、408 kDa的MRJP1寡聚體2和639 kDa的MRJP1寡聚體3，均由MRJP1單體和Apisimin組成。我們推測MRJP1寡聚體2和3分別為MRJP1寡聚體1的二倍體和三倍體。根據(jù)

5、中低壓尺寸排阻色譜，Native-PAGE電泳和質(zhì)譜結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)MRJP1是蜂王漿中含量最多的蛋白，在天然狀態(tài)下MRJP1在蜂王漿中主要以寡聚體形式存在，228 kDa的MRJP1寡聚體1的含量最多，MRJP1單體的含量很少。
　　4.利用同步輻射真空紫外圓二色譜技術(shù)對五個(gè)單一主蛋白在25℃下進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)測定，結(jié)果表明天然狀態(tài)下，MRJP1-3主要以β折疊和無規(guī)則卷曲組成，α螺旋很少。
　　5.結(jié)合電泳分析、蛋白酶解法、茚

6、三酮法、全自動(dòng)氨基酸分析等技術(shù)，確定了蜂王漿蛋白在SEC-HPLC上的9個(gè)色譜峰，即峰1主要為MRJP1寡聚體2，峰2主要為MRJP1寡聚體1，峰3主要為MRJP3，峰4主要為MRJP2和少量的MRJP1單體，峰5-9為一些游離氨基酸和小肽。
　　6.使用高效液相尺寸排阻色譜(SEC-HPLC)分析在不同儲(chǔ)存條件下蜂王漿蛋白的變化，結(jié)果表明:新鮮蜂王漿在冷凍（-18℃）儲(chǔ)存6個(gè)月內(nèi)蛋白成分基本無變化;在4℃下儲(chǔ)存1個(gè)月后，蛋白成分

7、出現(xiàn)緩慢變化;在室溫下儲(chǔ)存一個(gè)月內(nèi)，就會(huì)出現(xiàn)較為明顯的成分變化。在室溫和4℃條件下隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長，670 kDa、290 kDa MRJP1寡聚體和MRJP1單體呈現(xiàn)下降趨勢，而新出現(xiàn)的700 kDa和440 kDa寡聚體呈現(xiàn)上升趨勢。另外，通過SEC-HPLC檢測蜂王漿蛋白，發(fā)現(xiàn)當(dāng)蜂王漿中主蛋白峰1面積比小于0.50，峰2面積比大于0.55，峰N面積比小于0.02時(shí)，可以認(rèn)為蜂王漿是新鮮的。因此我們建立了一個(gè)基于SEC-HPLC檢