cADPR在哮喘致敏血清和細(xì)胞因子所致鼠支氣管平滑肌細(xì)胞應(yīng)激時(shí)鈣反應(yīng)增強(qiáng)中的作用.pdf

1、支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是一種病因和發(fā)病機(jī)制都十分復(fù)雜的氣道慢性炎癥性疾病，氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性是它的重要特征。支氣管平滑肌細(xì)胞作為氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的主要效應(yīng)細(xì)胞，它的鈣濃度變化影響著收縮性，細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)和細(xì)胞因子的釋放。Th2 類細(xì)胞因子白介素-5（IL-5）、白介素13（IL-13）
　　 以及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在哮喘的發(fā)生、發(fā)展的過程中扮演著重要的角色。
　　 研究表明細(xì)胞因子和哮喘致敏血清可調(diào)

2、節(jié)氣道平滑肌細(xì)胞的鈣反應(yīng)。環(huán)腺苷二磷酸核糖（cADPR），一種重要的鈣調(diào)節(jié)的第二信使，通過細(xì)胞內(nèi)鈣釋放受體雷尼丁受體（RyR）發(fā)揮著作用。FK506 結(jié)合蛋白12.6（FKBP12.6）是免疫抑制蛋白超家族的主要受體結(jié)合蛋白，具有通過結(jié)合RyR2 上的四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)來穩(wěn)定該受體的作用。
　　 目的：
　　 本項(xiàng)目的研究是研究cADPR在哮喘致敏血清和細(xì)胞因子處理導(dǎo)致的鼠支氣管平滑肌細(xì)胞對(duì)刺激劑的鈣反應(yīng)增強(qiáng)中的作用，及其作用

3、是否通過影響FKBP12.6和RyR2的的結(jié)合活性。從而探討cADPR在哮喘發(fā)病機(jī)制的作用，為臨床預(yù)防和治療哮喘提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1．用組織貼塊法原代培養(yǎng)鼠支氣管平滑肌細(xì)胞。
　　 2．用哮喘致敏血清和細(xì)胞因子處理鼠支氣管平滑肌細(xì)胞后，用鈣離子熒光指示劑Fura-2 標(biāo)記后，采用實(shí)時(shí)鈣熒光成像技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)胞漿游離鈣濃度（[Ca2+]I）的變化。觀察哮喘致敏血清和細(xì)胞因子處理后，10μm

4、ol/L 緩激肽和10μmol/L 乙酰膽堿分別刺激引起的胞漿內(nèi)游離鈣的動(dòng)態(tài)變化。以及8-Br-cADPR和3-Deaza-cADPR 依次孵育細(xì)胞后，10μmol/L 緩激肽刺激引起的胞漿內(nèi)游離鈣的動(dòng)態(tài)變化。
　　 3．用熒光分光光度計(jì)來檢測(cè)哮喘致敏血清和細(xì)胞因子處理后的鼠支氣管平滑肌細(xì)胞中ADP-ribose cyclase的活性變化。
　　 4．免疫熒光染色檢測(cè)哮喘致敏血清和細(xì)胞因子處理對(duì)FKBP12.6和RyR2

5、的共定位的影響，以及用cADPR的類似物3-Deaza-cADPR 處理后的共定位變化。
　　 5．用免疫共沉淀法測(cè)定哮喘致敏血清和細(xì)胞因子處理后的鼠支氣管平滑肌細(xì)胞FKBP12.6和RyR2的結(jié)合活性的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1．細(xì)胞的形態(tài)與“波峰---波谷”樣結(jié)構(gòu)以及平滑肌肌動(dòng)蛋白α的特異性表達(dá)證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞為鼠支氣管平滑肌細(xì)胞。
　　 2.哮喘致敏血清和細(xì)胞因子處理后的鼠支氣管平滑肌細(xì)胞，乙酰膽

6、堿、緩激肽誘發(fā)的鈣升高的幅度都明顯高于它們的對(duì)照組。
　　 3．8-Br-cADPR和3-Deaza-cADPR 依次預(yù)先作用哮喘致敏血清和細(xì)胞因子處理后的鼠支氣管平滑肌細(xì)胞，緩激肽誘發(fā)的鈣升高的幅度也都明顯高于它們的對(duì)照組。
　　 4．哮喘致敏血清和細(xì)胞因子處理后的鼠支氣管平滑肌細(xì)胞，ADP-ribosecyclase的活性也明顯高于它們的對(duì)照組。
　　 5．細(xì)胞因子處理后的鼠支氣管平滑肌細(xì)胞FKBP12.6和

7、RyR2 共定位明顯減少。3-Deaza-cADPR 導(dǎo)致哮喘致敏血清和細(xì)胞因子處理后的鼠支氣管平滑肌細(xì)胞FKBP12.6和RyR2 共定位進(jìn)一步減少。
　　 6．免疫共沉淀法也說明了哮喘致敏血清和細(xì)胞因子處理后的鼠支氣管平滑肌細(xì)胞FKBP12.6和RyR2 結(jié)合減少。
　　 結(jié)論：
　　 cADPR在哮喘致敏血清和細(xì)胞因子處理所致的氣道平滑肌細(xì)胞應(yīng)激時(shí)鈣反應(yīng)增強(qiáng)中發(fā)揮一定的作用，其作用可能與引起FKBP12.6