宿主體內(nèi)幽門(mén)螺桿菌基因組多態(tài)性分析及形成機(jī)制研究.pdf

1、D160355主體內(nèi)的基因多態(tài)性現(xiàn)象的變異來(lái)源。此外，作為一級(jí)致癌因子(grade I carcinogen)，幽門(mén)螺桿菌在致癌過(guò)程中所起的重要作用一直非常受到關(guān)注。sabA基因作為幽門(mén)螺桿菌在定植過(guò)程中重要的黏附素，在長(zhǎng)期定植以及致癌過(guò)程中有可能發(fā)揮重要的作用。同時(shí)，中國(guó)幽門(mén)螺桿菌的高感染率和高基因多態(tài)性百分比是否與地域和文化之間的差異有關(guān)，仍有待研究。因此，本實(shí)驗(yàn)還將對(duì)毒力因子sabA基因進(jìn)行遺傳信息多態(tài)性的研究。
　　 方

2、法：
　　 1.采用常規(guī)方法分離培養(yǎng)2009-2010年間中國(guó)杭州和重慶的幽門(mén)螺桿菌臨床株,并從原代培養(yǎng)平皿上隨機(jī)挑取18-24個(gè)單菌落，提取單菌落基因組DNA，使用屬特異性的16S rDNA引物通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)對(duì)菌落進(jìn)行鑒別。選用三個(gè)隨機(jī)引物(1254,1281和A11)來(lái)檢測(cè)原代菌落并建立原代RAPD圖譜。以各菌落的所有擴(kuò)增條帶完全相同為一種基因型，分別比較每個(gè)患者的基因型數(shù)目以確定其多態(tài)性。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株26695的

3、傳代菌落作為對(duì)照，以鑒定RAPD系統(tǒng)的穩(wěn)定性。其中隨機(jī)選取20名患者的原代分離培養(yǎng)物持續(xù)培養(yǎng)3代后，挑取18-24個(gè)單菌落以同樣的方法進(jìn)行RAPD的檢測(cè)，并對(duì)原代和傳代的RAPD圖譜進(jìn)行比較。同時(shí)，用Fisher精確檢驗(yàn)法檢測(cè)基因型數(shù)目與臨床疾病之間的相關(guān)性。
　　 2.為探尋同一患者不同基因型的變異來(lái)源，運(yùn)用多位點(diǎn)序列分型(MLST)的方法，分別對(duì)隨機(jī)選取的30名患者不同基因型的6個(gè)管家基因(atpA, efp, ppa, t

4、rpC, ureI andyphC)進(jìn)行擴(kuò)增。對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行純化后測(cè)序。序列比較由DNAssist 2.0軟件完成。通過(guò)各位點(diǎn)序列差異判斷其變異來(lái)源。
　　 3.采用PCR及測(cè)序和比較基因組方法分析42株國(guó)內(nèi)癌癥及癌前病變患者的幽門(mén)螺桿菌sabA基因CT 雙核苷酸重復(fù)序列調(diào)節(jié)區(qū)多態(tài)性。采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件的Fisher’s 精確檢驗(yàn)方法對(duì)陽(yáng)性率與疾病的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用MEGA 5.0聚類(lèi)軟件的construct

5、 UPGMA tree 功能聚類(lèi)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.對(duì)116名患者體內(nèi)分離幽門(mén)螺桿菌的RAPD檢測(cè)結(jié)果顯示宿主體內(nèi)的基因多態(tài)性非常普遍。在最初用隨機(jī)引物1254 檢測(cè)的結(jié)果中，宿主體內(nèi)幽門(mén)螺桿菌存在多種基因型的比例為83.6％。在使用3種隨機(jī)引物檢測(cè)后，基因多態(tài)性百分比達(dá)到99.1％，僅在一名胃炎患者中發(fā)現(xiàn)存在單一基因型。同一宿主內(nèi)有2-3種基因型在消化不良、胃炎、消化性潰瘍的患者占大多數(shù)，其比例分別為100

6、％、91.4％和77％。同一宿主內(nèi)有4種基因型主要出現(xiàn)在消化性潰瘍、萎縮性胃炎（癌前病變）和癌癥患者中，且比例相當(dāng)，分別為20％、20％和17％。同一宿主內(nèi)有5種基因型只在消化性潰瘍、萎縮性胃炎（癌前病變）和癌癥患者中發(fā)現(xiàn)，其比例分別為3％、20％和33％，呈梯度上升。臨床疾病分類(lèi)與基因型數(shù)目之間有相關(guān)性(P<0.05)。對(duì)其中20名患者的幽門(mén)螺桿菌傳代RAPD 圖譜和原代圖譜的比較分析發(fā)現(xiàn)， 經(jīng)體外傳代3次后90％患者(18/20)的

7、幽門(mén)螺桿菌基因型減少到只有一種，另外2名患者的基因型減小為2種，大部分基因型由于無(wú)法適應(yīng)體外培養(yǎng)環(huán)境而丟失。
　　 2.對(duì)30名患者不同基因型的菌落進(jìn)行多位點(diǎn)序列分析結(jié)果表明，26名患者不同基因型菌落的6個(gè)管家基因序列是完全相同的。另外3名患者只有atpA 位點(diǎn)DNA 序列有部分無(wú)義點(diǎn)突變，氨基酸序列沒(méi)有影響。而另1名嚴(yán)重復(fù)合型潰瘍患者的其中一種基因型所擁有的yphC 位點(diǎn)不僅DNA 序列有13個(gè)堿基突變，也導(dǎo)致了氨基酸序列的4

8、個(gè)氨基酸的改變，其中一個(gè)顛換(UAT 變成UAG)導(dǎo)致了一個(gè)新的終止子產(chǎn)生，提前終止了翻譯過(guò)程。由于每名患者都至少有5個(gè)管家基因序列是完全相同的，可認(rèn)為宿主體內(nèi)的基因多態(tài)性來(lái)自同一菌株的變異。
　　 3.sabA基因調(diào)節(jié)區(qū)的陽(yáng)性檢測(cè)率為85％，功能性sabA基因占所有測(cè)序菌株的55％。對(duì)隨機(jī)挑選的18株檢測(cè)陽(yáng)性的菌株進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示在堿基水平及蛋白質(zhì)水平存在顯著的遺傳多態(tài)性。對(duì)sabA基因調(diào)節(jié)區(qū)的氨基酸序列聚類(lèi)分析中發(fā)現(xiàn),

9、本研究的中國(guó)菌株與國(guó)際已經(jīng)完成測(cè)序的7株幽門(mén)螺桿菌可以明顯的分為兩個(gè)組，即中國(guó)組與西方組。
　　 結(jié)論：
　　 1.宿主體內(nèi)幽門(mén)螺桿菌基因組多態(tài)性現(xiàn)象在中國(guó)地區(qū)非常普遍；臨床疾病分類(lèi)和患者體內(nèi)幽門(mén)螺桿菌RAPD基因型數(shù)目有相關(guān)性。原代培養(yǎng)物在傳代培養(yǎng)后基因型減少。
　　 2.患者體內(nèi)的基因組多態(tài)性主要來(lái)源于同一菌株的變異。
　　 3.sabA基因CT 雙核苷酸重復(fù)序列調(diào)節(jié)區(qū)在中國(guó)菌株中普遍存在，且在翻譯水