急性排斥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分:
　　 目的：研究Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子IL-17在小鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)中的表達(dá)及意義。
　　 方法：建立小鼠頸部異位心臟移植模型，C57小鼠作為受體，BALB/c小鼠作為供體或受體，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為同系移植組和同種異體移植組，觀察2組移植心臟的存活時(shí)間。應(yīng)用realtime-PCR檢測(cè)各組移植心臟中IL-17、RORγt、IFN-γ mRNA在移植術(shù)后第1天至第7天的動(dòng)態(tài)表達(dá)水平；Western b

2、lot 檢測(cè)各組移植心臟中IL-17、RORγt、IFN-γ在移植術(shù)后第1、3、5、7天的表達(dá)水平；HE染色檢測(cè)移植術(shù)后第7天各組移植物中淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況；免疫熒光法觀察同種異體移植組術(shù)后第7天移植心臟中CD4+、CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，并檢測(cè)CD4+、CD8+T細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-17的表達(dá)。
　　 結(jié)果：同種異體移植組中，IL-17和RORγt mRNA的表達(dá)均早于IFN-γ，在移植術(shù)后第1天即可于移植心臟中檢測(cè)到兩者的表

3、達(dá)，而IFN-γ mRNA在移植術(shù)后第2天才可檢測(cè)到表達(dá)，三者mRNA的轉(zhuǎn)錄水平伴隨移植排斥反應(yīng)的進(jìn)程均逐漸升高。Western blot 檢測(cè)各組移植物中IL-17、RORγt、IFN-γ蛋白表達(dá)亦得出相似的結(jié)果。免疫熒光結(jié)果顯示，移植術(shù)后第7天同種異體移植組移植心臟中有大量CD4+、CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)，而細(xì)胞因子IL-17主要由CD4+T細(xì)胞即Th17細(xì)胞分泌。
　　 結(jié)論：Th17細(xì)胞參與了小鼠同種異體心臟移植急性排斥反應(yīng)

4、的發(fā)生和發(fā)展，對(duì)移植臟器中細(xì)胞因子IL-17的檢測(cè)可作為急性排斥反應(yīng)早期診斷的預(yù)見性和特異性指標(biāo)。
　　 第二部分:
　　 目的：觀察應(yīng)用anti-IL-6 mAb對(duì)同種異體小鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)的抑制作用，并探討其可能的作用機(jī)制。
　　 方法：以Balb/c和C57小鼠分別作為供受體，建立小鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為anti-IL-6 mAb組、anti-IL-17 mAb組及rat-IgG

5、對(duì)照組，術(shù)后每日通過觸診受鼠頸部移植心臟觀察各組小鼠移植心臟存活時(shí)間并結(jié)合組織學(xué)檢測(cè)。應(yīng)用realtime-PCR檢測(cè)各組移植心臟中細(xì)胞因子IL-17、IFN-γ及Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA表達(dá)水平，流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)各組受鼠脾臟CD4+、CD8+T細(xì)胞中IL-17、IFN-γ的表達(dá)。
　　 結(jié)果：Anti-IL-6 mAb、anti-IL-17 mAb輸注均可顯著抑制小鼠急性排斥反應(yīng)的發(fā)生，移植心臟存活時(shí)間

6、分別延長(zhǎng)至（22.0±2.3天）、（13±1.8天），anti-IL-6 mAb組抑制排斥反應(yīng)發(fā)生的效果更加顯著。組織病理學(xué)結(jié)果顯示anti-IL-6 mAb輸注可減輕移植心肌結(jié)構(gòu)的破壞，移植心臟中浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞明顯減少。Realtime-PCR結(jié)果顯示，anti-IL-6 mAb組移植心臟中IL-17、IFN-γ和RORγt mRNA的轉(zhuǎn)錄水平較rat-IgG對(duì)照組及未治療組顯著下降，anti-IL-17 mAb輸注可部分下調(diào)IFN-

7、γ mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示anti-IL-6 mAb組受鼠脾臟CD4+及CD8+T細(xì)胞中IFN-γ的比例均有不同程度的下降，且CD4+IFN-γ+T細(xì)胞較CD8+IFN-γ+T細(xì)胞下降更為明顯，同時(shí)CD4+IL-17+T （Th17）細(xì)胞的比例在anti-IL-6 mAb組中亦明顯下降。
　　 結(jié)論：anti-IL-6 mAb可有效抑制急性排斥反應(yīng)小鼠體內(nèi)Th17和Th1細(xì)胞的活化，并延長(zhǎng)同種異體心臟移植物的

8、存活時(shí)間。
　　 第三部分:
　　 目的：探討CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在anti-IL-6 mAb抑制同種異體心臟移植急性排斥反應(yīng)中的作用及機(jī)制。
　　 方法：以Balb/c和C57BL/6小鼠分別作為供受體，建立小鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為anti-IL-6 mAb組、anti-IL-17 mAb組及rat-IgG對(duì)照組，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組受鼠移植術(shù)后第7天脾臟及移植心臟中C

9、D4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例。分別于anti-IL-6 mAb組術(shù)后第1、3、5天給予anti-CD25 mAb輸注，于術(shù)后第7天取受鼠脾臟及移植心臟檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例，觀察移植心臟存活時(shí)間并結(jié)合組織學(xué)檢查；realtime-PCR檢測(cè)anti-CD25 mAb輸注后第3、7、10天移植心臟中IFN-γ mRNA的表達(dá)情況。使用去增殖的BALB/c 或C3H小鼠脾臟淋巴細(xì)胞作為刺激細(xì)胞

10、，各實(shí)驗(yàn)組受鼠移植物來源的淋巴細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，行混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。
　　 結(jié)果：Anti-IL-6 mAb組移植術(shù)后第7天CD4+CD25+T細(xì)胞的比例明顯升高，CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的比例表現(xiàn)出同樣的趨勢(shì)，而anti-IL-17 mAb組與未治療組比較無明顯差異。Anti-CD25 mAb輸注anti-IL-6 mAb組明顯縮短了小鼠移植心臟的存活時(shí)間（10.6±1.2天）

11、，伴隨著CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的比例明顯下降，同時(shí)移植物中IFN-γ mRNA的轉(zhuǎn)錄水平升高?；旌狭馨图?xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示anti-IL-6 mAb組受鼠淋巴細(xì)胞經(jīng)刺激后其細(xì)胞增殖程度較rat-IgG對(duì)照組、anti-IL-6 mAb+anti-CD25 mAb組及未治療組明顯下降，而針對(duì)來自第三方C3H小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞刺激則無此抑制效應(yīng)。
　　 結(jié)論：Anti-IL-6 mAb延長(zhǎng)小鼠移植心臟