NF-κB與IL-6在大鼠極限門靜脈結(jié)扎模型中的表達及作用機制.pdf

1、一、研究背景
　　 目前肝部分切除術(shù)仍是治療肝臟惡性腫瘤和肝門膽管癌首選的和最有效的方法，但大量肝組織被切除后殘余肝臟能否代償機體的功能需要是手術(shù)決策時必須面臨的問題。而小肝綜合征(small-for-size syndrome)及過度切取供體肝組織所導(dǎo)致的受體和供體的肝功能失代償也阻礙著活體肝移植的廣泛開展[1，2]。
　　 肝臟具有強大的再生能力，隨著生物實驗技術(shù)的不斷發(fā)展，人們在肝再生的分子機理和調(diào)控機制進行了大量

2、的研究，特別是轉(zhuǎn)基因和基因敲除小鼠動物模型的應(yīng)用使肝再生的分子生物學(xué)研究取得突破性進展[3]。肝再生的研究較多使用肝葉切除模型。大鼠行70％肝切除后，其肝臟體積可在大約1周左右時間得到完全恢復(fù)。肝再生增殖主要依賴于剩余肝組織的分化成熟的細胞重新活化，獲得增殖活性，啟動后續(xù)的DNA復(fù)制、細胞分裂和增殖[4]。不同類型的非實質(zhì)細胞能分泌各種細胞因子作用于肝細胞并相互作用，從而對肝再生進行精確的調(diào)控[5]。
　　 門靜脈結(jié)扎模型在上世

3、紀20年代即已有研究者使用，但未引起普遍重視，直至上世紀末因根治切除肝門部膽管癌而常需切除大量肝組織時才再次興起了對門靜脈結(jié)扎促進肝再生的研究。目前的研究結(jié)果表明部分門靜脈分支結(jié)扎后2周左右殘留肝再生達到高峰，大大提高了肝門部膽管癌的根治性切除率。這說明門靜脈壓力變化可能與肝臟的再生有著密切的關(guān)系[6]。
　　 肝再生過程中受到許多細胞因子和生長因子等的調(diào)控，且它們在肝再生過程中具有不同的生物學(xué)作用，肝臟再生的啟動與終止均有這些

4、相關(guān)因子的參與。核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)是多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的白介素-6(IL-6)在各種各樣的基因調(diào)節(jié)的炎癥、增殖反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[4]。近年來國內(nèi)外有關(guān)學(xué)者已對NF-κB和IL-6在大鼠PH模型中作為啟動肝再生的細胞因子做了大量研究[7]。PH術(shù)后，創(chuàng)傷可刺激肝細胞迅速釋放TNF-α及其他細胞因子，從而激活NF-κB，發(fā)生核轉(zhuǎn)移，其下游基因隨之活化，由于IL-6基因主要有3個順式結(jié)合位點：NF-κB、C/EBPβ、

5、AP-1，因此IL-6表達增加。IL-6與其受體復(fù)合物(gp130/IL-6Rα)結(jié)合，激活JAK激酶，使STAT1和STAT3發(fā)生磷酸化，活化的STAT3和其他的轉(zhuǎn)錄因子(C/EBPβ、AP-1)增強一些與細胞增殖有關(guān)因子的表達，如c-myc、c-fos，協(xié)同生長因子(如HGF、EGF等)促進細胞發(fā)生有絲分裂，進行增殖，同樣也激活了下游的MAPK信號通路，而該通路也可以促進與生長、分化、分裂有關(guān)的基因的表達，介導(dǎo)組織細胞的增殖。但其是

6、否在肝再生中發(fā)揮重要作用，目前文獻報道尚少。
　　 盡管既往已經(jīng)從不同角度進行了大量的研究和探索并已取得了一些初步的結(jié)論，但大多數(shù)研究均是以肝葉切除為模型，或是以肝細胞的增生為研究主體，因而結(jié)果及結(jié)論均有一定的局限性。本實驗通過建立90％極限門靜脈分支結(jié)扎動物模型，研究NF-κB、IL-6等細胞因子在極限門靜脈分支結(jié)扎導(dǎo)致的肝再生過程中的作用機制。
　　 二、課題思路：
　　 (1)建立90％極限門靜脈分支結(jié)扎動

7、物模型，為臨床上對晚期特大肝癌和廣泛肝內(nèi)膽管結(jié)石患者手術(shù)前進行預(yù)處理而避免肝衰竭的發(fā)生提供理論依據(jù)。
　　 (2)探討NF-κB與IL-6在90％極限門靜脈分支結(jié)扎大鼠的肝再生過程中的作用機制。
　　 三、材料與方法：
　　 雄性Sprague-Dawley大鼠96只，體質(zhì)量(220±20)g，由四川大學(xué)實驗動物中心提供。實驗大鼠隨機分為2組：實驗組和對照組各48只，每組又隨機分為8個亞組，每組6只，分別為術(shù)后0

8、.5d組、1d組、3d組、5d組、7d組、14d組、21d組和28d組。
　　 實驗組：
　　 1.動物模型制作：
　　 采用1.5％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。參照文獻方法[8]，由正中縱切口開腹，手術(shù)顯微鏡下以4-0絲線結(jié)扎供應(yīng)肝右葉及尾葉的門靜脈右支和供應(yīng)左外葉及中葉的門靜脈支，只留下一細小的通向二乳突葉的門靜脈支未結(jié)扎，肝動脈及膽管保持完整。被結(jié)扎側(cè)肝臟約占全肝質(zhì)量的90％。
　　 2.測定PVP：<

9、br>　　 將每組達到相應(yīng)觀察時間尚存活的大鼠經(jīng)腸系膜總靜脈向門靜脈主干插管后測定門靜脈壓力(PVP)，并立即處死大鼠取肝臟組織做相應(yīng)檢測和觀察。
　　 3.觀察指標：
　　 (1)觀察肝臟的色澤和質(zhì)地，用電子天平分別測量各組大鼠的總肝質(zhì)量和非結(jié)扎側(cè)肝葉質(zhì)量，計算非結(jié)扎側(cè)肝葉所占百分比。
　　 (2)非結(jié)扎側(cè)肝葉常規(guī)固定包埋及切片，HE染色觀察病理結(jié)構(gòu)的改變。
　　 (3)免疫組化S-P法對非結(jié)扎側(cè)肝葉

10、肝細胞增殖(PCNA)進行檢測分析，計算其平均陽性率。
　　 (4)采用原位末端標記技術(shù)(TUNEL法)對非結(jié)扎側(cè)肝葉肝細胞凋亡進行定量分析，計算其平均陽性率。
　　 (5)免疫組化S-P法檢測非結(jié)扎側(cè)肝葉肝組織NF-κB、IL-6的表達，并測定其平均累積光密度值(IOD)。
　　 對照組：假手術(shù)組僅游離出門靜脈分支，不結(jié)扎即關(guān)腹，其他實驗過程同實驗組。
　　 四、結(jié)果：
　　 (1)48只90％

11、PBL實驗組大鼠中46只存活(21d組和28d組各死亡一只)，總存活率為95.8％。
　　 (2)結(jié)扎側(cè)肝葉肝臟顏色變暗，逐漸開始萎縮，非結(jié)扎側(cè)肝葉占總肝質(zhì)重的比例隨時間推移而增加，12h內(nèi)增加較緩慢，而24h-5d則增加速度明顯加快，5d以后呈緩慢增加，7d達“平臺期”，重量比例增加進一步變緩。全肝總質(zhì)量僅在術(shù)后第1d-3d略低于正常水平，其余時間點則與正常水平接近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 (3)門靜脈分支結(jié)扎后門靜

12、脈壓力隨即升高，12h達到高峰(P<0.01)，12h-5d逐漸下降，但仍高于正常水平。7d-28d則與正常水平接近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 (4)對照組大鼠肝臟顯示以中央靜脈為中心肝細胞呈放射狀排列。門靜脈分支結(jié)扎術(shù)后非結(jié)扎側(cè)肝臟顯示術(shù)后12h肝細胞輕度腫脹，匯管區(qū)、小葉間血管、膽管界限清楚；術(shù)后第1d肝細胞即開始明顯的增殖.有較多的分裂相存在，伴有核增大，匯管區(qū)、小葉間血管擴張充血；術(shù)后3d-5d肝細胞核分裂活躍，匯管區(qū)見

13、炎細胞浸潤；術(shù)后第7d-14d亦可見較多的分裂相，肝細胞核增大；術(shù)后第21d-28d可見間質(zhì)少量炎細胞浸潤。小膽管增生，肝索結(jié)構(gòu)清楚，肝竇清楚。
　　 (5)對照組大鼠肝組織中有少量PCNA表達。術(shù)后非結(jié)扎側(cè)肝葉12h開始PCNA的表達量呈顯著增加(P<0.01)，可見較多PCNA陽性細胞；至術(shù)后5d達高峰(P<0.01)，可見大量PCNA陽性細胞；自7d-14d逐漸下降，但仍高于正常水平(P<0.05)，術(shù)后21d恢復(fù)至術(shù)前水

14、平(P>0.05)，僅見少量PCNA陽性細胞。
　　 (6)對照組大鼠肝臟和實驗組術(shù)后非結(jié)扎側(cè)肝臟僅見極少量凋亡細胞。
　　 (7)對照組肝細胞胞質(zhì)可見少量NF-κB和IL-6表達，極少見核表達，實驗組非結(jié)扎側(cè)肝葉NF-κB和IL-6的表達術(shù)后逐漸增加，并可見核陽性表達細胞，分別至術(shù)后1d和0.5d達高峰，隨后逐漸減少，直至恢復(fù)至術(shù)前水平(P>0.05)。
　　 (8)門靜脈壓力在術(shù)后1d組、3d組、5d組和非結(jié)

15、扎側(cè)肝葉肝細胞PCNA的表達呈正相關(guān)，在術(shù)后14d組與非結(jié)扎側(cè)肝葉肝細胞PCNA的表達呈負相關(guān)；大鼠肝臟PCNA的表達在術(shù)后0.5d、1d、14d、21d、28d組與肝內(nèi)NF-κB表達呈正相關(guān)；大鼠肝臟PCNA的表達在術(shù)后1d、14d、21d組與肝內(nèi)IL-6表達呈正相關(guān)；大鼠肝臟NF-κB的表達在術(shù)后1d、7d、21d、28d組與肝臟IL-6表達呈正相關(guān)。
　　 五、結(jié)論：
　　 90％門靜脈分支結(jié)扎術(shù)后引起未結(jié)扎側(cè)肝細