不同凍存條件對(duì)人顆粒脂肪活性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　探索不同凍存條件對(duì)人顆粒脂肪活力的影響，尋求更為滿意的顆粒脂肪凍存條件，為臨床自體脂肪移植提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　常規(guī)方法收集41例自體脂肪移植求美者大腿內(nèi)側(cè)顆粒脂肪標(biāo)本，經(jīng)生理鹽水漂洗2次靜置分離后加入相應(yīng)留存脂肪量等體積的含60%小牛血清+25%DMEM高糖培養(yǎng)基（Dulbecco Modified Eagle Medium，伯克改良伊格爾培養(yǎng)基）+15%DMSO（Dimethyl sulfox

2、ide，二甲基亞砜）低溫凍存保護(hù)液凍存。將所獲脂肪標(biāo)本一式三份，按照-20℃（普通冰箱）、-80℃（深低溫冰箱）和-196℃（液氮）3種不同條件下凍存。選擇凍存3個(gè)月和6個(gè)月的標(biāo)本復(fù)溫，通過蘇木精-伊紅(HE)染色觀察脂肪細(xì)胞形態(tài)、臺(tái)盼藍(lán)染色法分析脂肪細(xì)胞存活率、肌酸激酶測(cè)定酶活力、免疫組化CD105檢測(cè)脂肪干細(xì)胞數(shù)量，比較三種凍存溫度下凍存3個(gè)月及6個(gè)月后脂肪細(xì)胞活力變化情況。應(yīng)用經(jīng)三種溫度凍存6個(gè)月后的顆粒脂肪組織進(jìn)行裸鼠體內(nèi)移植建

3、模，于6只裸鼠背部皮下進(jìn)行注射移植，4周后取出，測(cè)量體積、HE染色及透射電鏡觀察并比較移植后脂肪組織的成活及血管化情況。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。
　　結(jié)果：
　　1.體外檢測(cè)脂肪細(xì)胞活力：
　?。?）臺(tái)盼藍(lán)染色法脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)分析脂肪細(xì)胞存活率，-20℃、-80℃、-196℃三種溫度下凍存3個(gè)月后的脂肪細(xì)胞存活率分別是18.79±2.51%、86.21±1.51%、90.05±2.77%；

4、凍存6個(gè)月后分別是8.67±1.83%、81.34±2.39%、89.31±2.65%，三組組間比較Ρ值均<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在同一凍存時(shí)間下，-20℃、-80℃及-196℃各組的脂肪細(xì)胞存活率逐漸升高，-196℃溫度凍存后存活的脂肪細(xì)胞數(shù)量最多，-20℃溫度下凍存后存活脂肪細(xì)胞數(shù)量最少（Ρ<0.05）。在同一凍存溫度下，-20℃及-80℃凍存3個(gè)月組的脂肪細(xì)胞存活率明顯高于6個(gè)月組，-196℃下兩組凍存時(shí)間無顯著性差異（Ρ>

5、0.05）。
　　（2）肌酸激酶測(cè)定，-20℃、-80℃、-196℃三種溫度下凍存3個(gè)月后的OD值是0.042±0.003、0.072±0.002、0.081±0.002；凍存6個(gè)月后分別是0.038±0.002、0.063±0.002、0.079±0.003，三組組間比較Ρ值均<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相同溫度下，-20℃和-80℃凍存3個(gè)月的酶活力高于凍存6個(gè)月（Ρ<0.05），-196℃凍存溫度下，3個(gè)月及6個(gè)月無差異（

6、Ρ>0.05）；相同凍存時(shí)間下，-196℃組酶活力最高，-80℃組次之，-20℃組最低（Ρ<0.05）。
　?。?）各組HE染色顯微鏡下比較脂肪細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，-20℃條件下凍存3個(gè)月組細(xì)胞膜破裂嚴(yán)重，網(wǎng)狀連接部分中斷，偶可見細(xì)胞核存在；而6個(gè)月組細(xì)胞膜破裂更加嚴(yán)重，網(wǎng)狀連接中斷，細(xì)胞核幾乎消失，且存在較多壞死區(qū)及囊腔和空泡；-80℃組兩段時(shí)間較-20℃組明顯改善；-196℃條件下凍存3個(gè)月及6個(gè)月兩組間脂肪細(xì)胞形態(tài)基本保持正常，凍

7、存后基本未受損傷。各組經(jīng)免疫組化CD105染色后，-20℃組未見ADSCs，在-80℃組及-196℃組僅見少數(shù)ADSCs。
　　2.顆粒脂肪裸鼠移植建模：注射移植凍存顆粒脂肪于裸鼠背部皮下，4周后取出，經(jīng)-20℃、-80℃及-196℃三種溫度凍存6個(gè)月的顆粒脂肪移植后體積減少率分別為90%、65%、55%。HE染色形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，-20℃組脂肪細(xì)胞形態(tài)尚可，網(wǎng)狀纖維欠發(fā)達(dá)，仍可見細(xì)胞膜破裂情況，其余兩組存活狀況良好，可見完整脂肪小

8、葉結(jié)構(gòu)，細(xì)胞形態(tài)逐漸趨于穩(wěn)定，部分血管長(zhǎng)入。透射電鏡觀察凍存脂肪移植4周后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，-20℃組含較多新生脂肪細(xì)胞，-80℃及-196℃組脂肪細(xì)胞更加成熟，-196℃組已可見成熟脂肪細(xì)胞輪廓，并且在脂肪細(xì)胞周圍長(zhǎng)入的新生毛細(xì)血管數(shù)量最多。
　　結(jié)論：
　　1、使用經(jīng)凍存的顆粒脂肪組織進(jìn)行移植具可行性。
　　2、-196℃凍存組脂肪細(xì)胞活性優(yōu)于-80℃及-20℃凍存組。
　　3、-196℃下可凍存6個(gè)月，甚至更長(zhǎng)