Integrinα9在人ADSCs向LECs分化過程中表達變化的相關研究.pdf

1、目的：從人體脂肪組織中分離培養(yǎng)出脂肪源性間充質干細胞(Adipose-derived stem cells，ADSCs)，誘導其向淋巴管內皮細胞(Lymphatic endothelial cells，LECs)分化，同時探討分化過程中整合蛋白α9(integrinα9)表達的變化，旨在尋找淋巴水腫分子治療靶點，為ADSCs應用于淋巴水腫的分子治療奠定實驗基礎。
　　方法：
　　①從吸脂術后廢棄的人體脂肪組織中分離培養(yǎng)出AD

2、SCs，倒置相差顯微鏡觀察原代及傳代細胞的形態(tài)特征。
　?、诹魇郊毎麅x(FCM)檢測第三代ADSCs表面特征性抗原的表達，達到鑒定ADSCs的目的;MTT法繪制生長曲線，明確傳代過程中細胞生長情況是否發(fā)生改變。
　?、塾萌搜軆绕ぜ毎L因子C(VEGF-C)、人血管內皮細胞生長因子A(VEGF-A)、血小板源性生長因子BB(PDGF-BB)誘導其向LECs方向分化，同時以人LECs作為陽性對照組。
　?、躓ester

3、n Blot檢測各組細胞LECs表面特征性抗原淋巴管內皮細胞透明質酸受體-1(LYVE-1)、血管內皮細胞特征性抗原CD34及integrinα9的表達，明確實驗組向LECs的分化，同時探討integrinα9在誘導前后表達的變化。
　　⑤流式細胞儀(FCM)檢測各組細胞周期，分析分化前后細胞周期的改變，使用SPSS17.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。
　　結果：
　?、貯DSCs貼壁生長，呈長梭形，對密度的依賴性較高，傳

4、代后細胞生長速度明顯增快，第1、3、5代細胞生長曲線均為典型的“S”形。
　?、贔CM檢測抗原結果:CD29、CD90陽性表達，CD34、CD45陰性表達，與MSCs的特性相符合。
　?、踂estern Blot結果顯示:陽性對照組中LECs表面特征性抗原LYVE-1的表達為陽性，血管內皮細胞表面特征性抗原CD34為陰性表達，而integrinα9的表達與LYVE-1的表達趨勢一致，亦為陽性表達;實驗組LYVE-1亦為陽性表

5、達、且CD34為陰性表達，明確了LECs的生成，integrinα9為陽性表達，同時LYVE-1及integrinα9的表達水平低于二者在陽性對照組中的表達;陰性對照組中LYVE-1、integrinα9及CD34的表達均為陰性。
　　④FCM檢測各組細胞周期，分析各組細胞G0/G1期細胞比例，其中實驗組(65.46±2.73)％、陽性對照組(62.35±0.50)％明顯小于陰性對照組(88.79±1.53)％，使用方差分析比較三

6、組細胞G0/G1期細胞比例的差異（F=186.77，P＜0.01），差異具有統(tǒng)計學意義。SNK法進行兩兩比較，實驗組G0/G1期百分比顯著小于陰性對照組(q=22.06，P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義;陽性對照組G0/G1期百分比顯著小于陰性對照組(q=25.01，P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。實驗組與陽性對照組之間G0/G1期百分比無明顯差異(q=2.94，P=0.083＞0.05)。
　　結論：
　?、貯DSC

7、s貼壁生長、長梭形，原代培養(yǎng)時細胞呈現(xiàn)明顯的集落生長趨勢，且對密度的依賴性高，傳代后細胞增殖速率明顯增強，傳代后細胞的形態(tài)及生長情況不發(fā)生明顯改變，傳代后細胞的純度較高，可用于ADSCs向LECs分化的研究。
　?、谑褂肰EGF-A、VEGF-C及PDGF-BB可成功將ADSCs誘導分化為LECs（LYVE-1表達陽性、CD34表達陰性，證實了LECs的生成），ADSCs具有向LECs分化的潛能，在對各組細胞周期進行檢測的時候我們