HIV-1劣勢(shì)耐藥突變對(duì)艾滋病患者二線治療效果影響的研究.pdf

1、目的:
　　 艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)是由艾滋病病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)引起的一種傳染病，尚無法治愈。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy，HAART)是目前治療艾滋病最有效的方法。治療后一些患者產(chǎn)生了耐藥，成為影響抗病毒治療效果的最主要原因。
　　

2、HIV-1基因型耐藥檢測(cè)方法因其檢測(cè)快速、方便、成本低而受到廣泛應(yīng)用，但是這種方法檢測(cè)不到占HIV-1準(zhǔn)種20％以下的劣勢(shì)耐藥突變。在特異的藥物選擇壓力下，有劣勢(shì)耐藥突變的病毒復(fù)制能力高于野生型病毒，會(huì)持續(xù)低水平復(fù)制并最終進(jìn)化為優(yōu)勢(shì)病毒，加速耐藥的產(chǎn)生的抗病毒治療的失敗，研究HIV-1劣勢(shì)耐藥突變能更好地指導(dǎo)艾滋病病人合理用藥。目前，國外關(guān)于HIV-1劣勢(shì)耐藥突變對(duì)治療效果的影響具有爭議。在我國關(guān)于劣勢(shì)耐藥突變的研究較少，僅限于方法學(xué)的

3、討論以及個(gè)別劣勢(shì)耐藥突變的檢測(cè)，關(guān)于HIV-1劣勢(shì)耐藥突變對(duì)于治療效果的影響還未見報(bào)道。
　　 我國于2003年開始施行免費(fèi)抗病毒治療。到2011年底，我國艾滋病感染者有15萬人接受了免費(fèi)抗病毒治療。在抗病毒治療后，很多病人體內(nèi)的病毒未被有效抑制，耐藥率也隨治療時(shí)間的延長逐年增加。越來越多的患者一線抗病毒治療失敗需要更換二線治療方案。
　　 在我國主要應(yīng)用in-house基因型耐藥檢測(cè)方法，這種方法檢測(cè)不到占HIV-1準(zhǔn)

4、種20％以下的劣勢(shì)耐藥突變。一線抗病毒治療失敗后病人劣勢(shì)耐藥突變情況如何？如果更換二線藥前有針對(duì)藥物的劣勢(shì)耐藥突變是否會(huì)影響其效果？為回答上述問題，本研究對(duì)我國河南地區(qū)一線治療失敗后更換二線藥物方案治療前的艾滋病感染者進(jìn)行HIV-1劣勢(shì)耐藥突變檢測(cè)，探討HIV-1劣勢(shì)耐藥突變對(duì)二線治療效果的影響，從而為我國HIV-1耐藥檢測(cè)方法的選擇、優(yōu)化提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、研究對(duì)象
　　 參照2007版《國

5、家免費(fèi)艾滋病抗病毒藥物治療手冊(cè)》中艾滋病病人二線方案入選標(biāo)準(zhǔn)，在我國河南省尉氏縣于2009年8月、2010年1月招募195名患者。對(duì)于符合二線方案入選標(biāo)準(zhǔn)的患者，根據(jù)其二線抗病毒治療18-24個(gè)月后病毒載量結(jié)果分為病毒抑制組與病毒未抑制組。在兩組人群中，根據(jù)換藥前病人CD4、VL、年齡、性別、依從性等相匹配的原則挑取23名患者。病毒未抑制11人，病毒載量5066-896965 copies/ml。病毒抑制12人，病毒載量0-396cop

6、ies/ml。所有患者簽署了知情同意書，二線抗病毒治療方案均使用WHO推薦的拉米夫定(3TC)+替諾福韋(TDF)和諾匹那韋+利托那韋(克立芝，LPV/r)。
　　 病毒未抑制:經(jīng)HAART后血漿中病毒載量＞400 copies/ml。
　　 病毒抑制:經(jīng)HAART后血漿中病毒載量＜400 copies/ml。
　　 2、CD4+T淋巴細(xì)胞測(cè)定
　　 20μl CD4/CD8/CD3 TriTEST試劑加

7、入TruCOUNT管中，加入50μl抗凝血，室溫避光15min，加入免洗溶血素450μl，室溫避光15min，用FACS MMLTISET軟件檢測(cè)并進(jìn)行自動(dòng)分析、計(jì)算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值及相應(yīng)比值等。
　　 3、病毒載量測(cè)定
　　 以1ml血漿采用Roche公司COBAS TaqMan自動(dòng)載量儀檢測(cè)病毒載量。
　　 4、病毒核酸提取
　　 以抗凝140μl血漿提取病毒基因組RNA，

8、按照QIAamp Viral RNA Mini Kit說明書步驟提取RNA，提取物溶于60μl洗脫液中。
　　 5、巢氏聚合酶鏈反應(yīng)(nest-PCR)
　　 以外側(cè)引物對(duì):MAW26(5'-TTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC-3’;HXB22028-2050)和RT21(5’-CTGTATTTCTGCTATTAAGTCTTTTGATGGG-3’; HXB23509-3539);內(nèi)側(cè)引物對(duì):PRO-1(5’-

9、CAGAGCCAACAGCCCCACCA-3’;HXB23509-3539)和RT4R(5’-CTTCTGTATATCATTGACAGTCCAGCT-3’;HXB23509-3539)，用于擴(kuò)增HIV-I pol序列。
　　 6、PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化
　　 取產(chǎn)物45μl進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)Ultra-Violet Product凝膠成像后與marker比對(duì)，確認(rèn)所需片段，用QIAquik Gel Extractio

10、n Kit試劑盒純化基因片段。
　　 7、TA克隆
　　 擴(kuò)增的pol基因片段插入克隆載體pMD18T-vector，轉(zhuǎn)入化學(xué)感受態(tài)菌DH5a擴(kuò)大培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒DNA測(cè)序
　　 8、序列分析
　　 克隆獲得的序列用Sequncher軟件進(jìn)行拼接，用BioEdit軟件進(jìn)行序列比對(duì)。用MEGA5.0軟件的進(jìn)行系統(tǒng)樹分析，登錄美國斯坦福大學(xué)HIV耐藥數(shù)據(jù)庫(http://hivdb.stanford.edu

11、)在線進(jìn)行HIV耐藥突變情況和耐藥性分析。
　　 9、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 用SPSS16統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;數(shù)據(jù)使用四分位間距;基線兩組的比較用Fisher檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)。Fisher檢驗(yàn)分析劣勢(shì)耐藥突變與病毒學(xué)效果的關(guān)系;p＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 一、換藥前研究對(duì)象基本資料
　　 （一）基本人口學(xué)信息
　　 本研究23例病人，應(yīng)用統(tǒng)一二線方案3TC+ TDF+L

12、PV/r進(jìn)行治療。病毒未抑制組11人，病毒抑制組12人。換藥前病毒未抑制組病毒載量(log)為5.179(4.474-5.524)、CD4計(jì)數(shù)為137(20-281)、年齡47(42-55)、男性7人、女性4人。換藥前病毒抑制組病毒載量(log)為5.316(4.898-5.636)、CD4計(jì)數(shù)為164(94-333)、年齡45.5(39.5-53.3)、男性7人、女性5人。一線治療方案包括AZT+DDI+NVP、AZT+3TC+NVP

13、、D4T+DDI+NVP,兩組一線治療方案構(gòu)成和病毒載量、CD4計(jì)數(shù)、年齡、性別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性。
　　 （二）換藥前in-house基因型耐藥檢測(cè)結(jié)果
　　 23名患者均未檢測(cè)到蛋白酶抑制劑(PI)主要耐藥突變，對(duì)所有的PI敏感。病毒未抑制組11人中耐藥的有7人，病毒抑制組12人中耐藥的9人，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。病毒未抑制組4人對(duì)核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTI)耐藥，7人對(duì)非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(N

14、NRTI)耐藥。病毒抑制組對(duì)NRTI和NNRTI耐藥人數(shù)為8和9。病毒未抑制組的NRTI和NNRTI耐藥突變的數(shù)量和種類均少于病毒抑制組。
　　 在換藥前，有一部分患者對(duì)二線方案中的3TC和TDF產(chǎn)生了交叉耐藥。病毒未抑制組對(duì)3TC、TDF耐藥人數(shù)少于病毒抑制組，對(duì)3TC和TDF的耐藥評(píng)分值比病毒抑制組低。病毒未抑制組對(duì)3TC和TDF耐藥的人數(shù)為2、3，病毒抑制組為7、8。
　　 （三）應(yīng)用二線治療方案后服藥依從性

15、>　　 在服用二線治療藥物后，每年用調(diào)查隨訪表評(píng)估所有患者的服藥依從性。病毒抑制組與病毒未抑制組所有人按時(shí)服藥比例在95％以上，依從性較好。
　　 二、換藥前HIV-1劣勢(shì)耐藥突變檢測(cè)情況及劣勢(shì)耐藥突變對(duì)二線治療效果的影響
　　 （一）HIV-1劣勢(shì)耐藥突變檢測(cè)情況
　　 除了in house檢測(cè)到的耐藥突變外，21人檢測(cè)到了劣勢(shì)耐藥突變(in house均未檢測(cè)到)，平均每個(gè)患者檢測(cè)到了2-3個(gè)劣勢(shì)耐藥突變。

16、
　　 In-house結(jié)果顯示無耐藥突變的有7人（病毒未抑制4人，病毒抑制3人），其中6人檢測(cè)到了HIV-1劣勢(shì)耐藥突變。In-house檢測(cè)到NRTI/NNRTI耐藥突變的16人，15人檢測(cè)到了劣勢(shì)耐藥突變，突變不同于in-house檢測(cè)到的突變。
　　 除了NRTI/NNRTI劣勢(shì)耐藥突變外，我們還檢測(cè)到了PI劣勢(shì)主要耐藥突變:V82A/L90M/I47V/I50V等。
　　 （二）HIV-1劣勢(shì)耐藥突變對(duì)

17、治療效果的影響
　　 對(duì)克隆測(cè)序耐藥結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，病毒未抑制和抑制組耐藥人數(shù)多于in-house檢測(cè)結(jié)果，對(duì)二線方案中的3TC和TDF耐藥人數(shù)也增加。In-house基因型檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)3TC和TDF敏感的人中檢測(cè)到了3TC和TDF的劣勢(shì)耐藥突變。病毒未抑制組3人檢測(cè)到了3TC劣勢(shì)耐藥突變，1人有TDF劣勢(shì)耐藥突變。病毒抑制組1人有3TC劣勢(shì)耐藥突變。
　　 病毒未抑制組6人有PI劣勢(shì)主要耐藥突變，病毒抑制組4人有P

18、I劣勢(shì)主要耐藥突變。
　　 對(duì)兩組的PI劣勢(shì)主要耐藥突變進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，病毒未抑制組5人含有的劣勢(shì)主要耐藥突變(V82A/I50V/I47V)對(duì)二線治療方案中的LPV/r耐藥。病毒抑制組雖然4人含有PI劣勢(shì)耐藥突變，但僅1人含有的突變(V82A)對(duì)LPV/r耐藥，其余3人含有的PI劣勢(shì)耐藥突變對(duì)LPV/r潛在低度耐藥或敏感。病毒未抑制組有LPV/r劣勢(shì)耐藥突變的人的比例(5/11)高于抑制組(1/12)。
　　 病毒未抑制