AMPK對(duì)成肌細(xì)胞功能活性的影響及其代謝調(diào)節(jié)研究.pdf

1、背景和目的:
　　肌衛(wèi)星細(xì)胞是骨骼肌組織內(nèi)最主要的干細(xì)胞成分，它通過激活轉(zhuǎn)化為具有增殖分化能力的成肌細(xì)胞負(fù)責(zé)骨骼肌的生后生長(zhǎng)和損傷后再生，是骨骼肌損傷再生和可塑性的主要細(xì)胞基礎(chǔ)。近幾年研究顯示細(xì)胞能量代謝在干細(xì)胞的自我更新、增殖分化中具有重要調(diào)控作用，肌衛(wèi)星細(xì)胞在增殖分化進(jìn)程中也呈現(xiàn)了顯著的能量代謝模式的改變。腺苷酸活化的蛋白激酶(AMPK)是細(xì)胞內(nèi)能量代謝的關(guān)鍵感受和調(diào)控分子，活化的AMPK一方面抑制消耗ATP的合成代謝途徑，同

2、時(shí)啟動(dòng)產(chǎn)生ATP的細(xì)胞內(nèi)分解代謝，最終恢復(fù)或維持細(xì)胞能量代謝的平衡。本課題以AMPK為研究重點(diǎn)，首先觀察了激活A(yù)MPK對(duì)成肌細(xì)胞C2C12增殖分化及線粒體功能活性等性狀的影響，然后基于前期報(bào)道觀察了熱量限制對(duì)老年骨骼肌及肌衛(wèi)星細(xì)胞AMPK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。以深入闡明代謝因素參與干細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的可能機(jī)制，探討AMPK信號(hào)途徑對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化潛能的調(diào)節(jié)作用，發(fā)掘促進(jìn)老年骨骼肌組織損傷再生的潛在分子靶位。
　　方法:
　　1

3、.C2C12細(xì)胞的培養(yǎng)
　　C2C12成肌細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，分化培養(yǎng)基為含2％馬血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱溫度37℃，CO2濃度5％。
　　2.二甲雙胍處理后C2C12細(xì)胞AMPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)
　　C2C12細(xì)胞在含二甲雙胍（終濃度1mmol/L）的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)12h、24h、36h和48h后，WB檢測(cè)p-AMPKα、AMPKα和S

4、IRT1蛋白表達(dá)變化。
　　3.誘導(dǎo)AMPK活化后C2C12細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)
　　C2C12細(xì)胞在含二甲雙胍（終濃度1mmol/L）的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)培養(yǎng)0h、24h、48h后細(xì)胞增殖狀態(tài)，流式細(xì)胞周期分別檢測(cè)培養(yǎng)24h和48h后細(xì)胞周期的變化，同時(shí)以5-乙炔基-2-脫氧尿昔(Edu)摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)培養(yǎng)48h后DNA合成情況。
　　4.誘導(dǎo)AMPK活化后C2C12細(xì)胞肌原性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及

5、肌管形成的檢測(cè)
　　(1) C2C12細(xì)胞在含二甲雙胍（終濃度1mmol/L）的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，WB分別檢測(cè)培養(yǎng)12h、24h、36h和48h后細(xì)胞Pax7蛋白表達(dá)變化，Real-Time PCR分別檢測(cè)培養(yǎng)24h和48h后細(xì)胞MyoD mRNA表達(dá)變化。
　　(2) C2C12細(xì)胞首先在含二甲雙胍（終濃度1mmol/L）的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中預(yù)處理48h，然后在分化培養(yǎng)基條件下誘導(dǎo)其分化，通過Real-Time PCR分別檢測(cè)誘

6、導(dǎo)24h、48h和72h后Myogenin mRNA的表達(dá)，同時(shí)以吉姆薩染色檢測(cè)誘導(dǎo)72h后肌管形成情況，計(jì)算肌管融合指數(shù)（含2個(gè)以上細(xì)胞核的肌管比例）。
　　5.誘導(dǎo)AMPK活化后C2C12細(xì)胞線粒體膜電位的檢測(cè)
　　C2C12細(xì)胞在含二甲雙胍（終濃度1mmo l/L）的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過流式細(xì)胞儀以JC-1線粒體膜電位探針分別檢測(cè)培養(yǎng)24h和48h后細(xì)胞線粒體膜電位變化，同時(shí)以四甲基羅丹明乙酯(TMRE)線粒體膜電位

7、探針于激光共聚焦顯微鏡下檢測(cè)培養(yǎng)24h后細(xì)胞線粒體膜電位變化。
　　6.誘導(dǎo)AMPK活化后C2C12細(xì)胞線粒體分布、生成以及PGC1α表達(dá)的檢測(cè)
　　C2C12細(xì)胞在含二甲雙胍（終濃度1mmol/L）的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過Mito-Tracker Green探針標(biāo)記細(xì)胞線粒體，然后通過激光共聚焦和流式分別檢測(cè)細(xì)胞線粒體分布及生成情況。同時(shí)以WB檢測(cè)細(xì)胞PGC1α蛋白表達(dá)變化，以Real-Time PCR分別檢測(cè)細(xì)胞PGC1

8、αmRNA表達(dá)變化。
　　7.熱量限制動(dòng)物模型的建立
　　13月齡雄性C57BL/6小鼠30只，按照簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣法分為兩組:自由進(jìn)食組和40％熱量限制組，單籠飼養(yǎng)，自由飲水，一只熱量限制小鼠一周進(jìn)食量=自由進(jìn)食組小鼠平均每只一周進(jìn)食量×60％，平均分至每天，熱量限制12周。
　　8.熱量限制后小鼠骨骼肌AMPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)
　　WB檢測(cè)熱量限制后小鼠脛前肌p-AMPKα、AMPKα和SIRT1蛋白表達(dá)變

9、化。
　　9.熱量限制后小鼠骨骼肌線粒體形態(tài)的觀察以及PGC1α蛋白表達(dá)的檢測(cè)
　　透射電鏡觀察熱量限制后脛前肌線粒體形態(tài)的變化，分別計(jì)算線粒體的密度、長(zhǎng)度及寬度，WB檢測(cè)脛前肌PGC1α蛋白表達(dá)變化。
　　10.熱量限制后小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞AMPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)
　　肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離通過膠原酶和中性蛋白酶消化，然后通過多重?zé)晒鈽?biāo)記進(jìn)行流式分選，其中CD45-/CD11b-/Sca-1-/CXCR4+/C

10、D29+細(xì)胞為肌衛(wèi)星細(xì)胞;分選的細(xì)胞提取總蛋白，然后通過ELISA分別檢測(cè)p-AMPKα、SIRT1和PGC1α表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.C2C12細(xì)胞在二甲雙胍處理24h后，AMPKα的磷酸化水平即顯著升高(p＜0.05);SIRT1蛋白表達(dá)在處理組顯著上調(diào)，處理48h后與對(duì)照組差異最為明顯(p＜0.05)。
　　2.二甲雙胍誘導(dǎo)AMPK活化后，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)觀察顯示C2C12細(xì)胞增殖速度明顯減慢，OD45

11、0nm在48h時(shí)較對(duì)照組顯著下降(p＜0.01);同時(shí)細(xì)胞周期也表現(xiàn)出明顯變化，S期細(xì)胞比例隨處理時(shí)間不斷升高，48h時(shí)較對(duì)照組差異顯著(p＜0.05)，而G2/M期細(xì)胞比例則不斷減少;DNA合成檢測(cè)結(jié)果顯示，Edu陽性細(xì)胞比例在二甲雙胍處理48h后與對(duì)照組相比增加明顯(p＜0.01)。
　　3.二甲雙胍處理24h后，C2C12細(xì)胞Pax7蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著升高(p＜0.01)，并在此后的處理期間一直維持較高表達(dá)水平;MyoD

12、mRNA表達(dá)在處理48h后，與對(duì)照組相比下降明顯(p＜0.01);C2C12細(xì)胞通過二甲雙胍預(yù)處理后，分化條件下Myogenin mRNA的表達(dá)在各檢測(cè)點(diǎn)均較低，誘導(dǎo)72h后，Myogenin mRNA表達(dá)和肌管融合指數(shù)較對(duì)照組均顯著下降（均為p＜0.01）。
　　4.通過兩種不同線粒體膜電位探針檢測(cè)結(jié)果顯示，二甲雙胍處理24h后C2C12細(xì)胞線粒體膜電位較對(duì)照組下降明顯（均為p＜0.01）。
　　5.Mito-Tracke

13、r Green標(biāo)記檢查結(jié)果可以明顯的觀察到二甲雙胍處理48h后C2C12細(xì)胞線粒體趨向核周聚集分布，同時(shí)線粒體平均熒光強(qiáng)度較對(duì)照組顯著升高(p＜0.01);蛋白及mRNA檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，C2C12細(xì)胞在二甲雙胍處理24h后PGC1α蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)均顯著升高（分別為p＜0.01和p＜0.05）。
　　6.與對(duì)照組相比，熱量限制小鼠骨骼肌AMPKα磷酸化水平顯著上調(diào)(p＜0.01)，SIRT1蛋白表達(dá)也明顯升高(p

14、＜0.01)。
　　7.與對(duì)照組相比，熱量限制鼠骨骼肌線粒體密度明顯升高(p＜0.01)，體積明顯增大（長(zhǎng)度:p＜0.05，寬度:p＜0.01）;同時(shí)PGC1α蛋白表達(dá)也顯著上調(diào)(p＜0.05)。
　　8.熱量限制鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞p-AMPKα、SIRT1以及PGC1α表達(dá)較對(duì)照組均明顯升高（分別為p＜0.01; p＜0.05; p＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.二甲雙胍能夠激活C2C12細(xì)胞AMPK信號(hào)通路，促

15、進(jìn)其下游去乙?；窼IRT1等蛋白表達(dá)的上調(diào)。
　　2.二甲雙胍能夠抑制C2C12細(xì)胞增殖，使其細(xì)胞周期阻滯于S期;同時(shí)能夠上調(diào)Pax7蛋白的表達(dá)，下調(diào)MyoD基因的轉(zhuǎn)錄水平，在分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)條件下抑制其定向分化，從而維持C2C12細(xì)胞的低分化狀態(tài)。這些影響可能依賴于二甲雙胍處理后C2C12細(xì)胞內(nèi)AMPK通路的活化及其相關(guān)蛋白表達(dá)的上調(diào)。
　　3.通過二甲雙胍激活A(yù)MPK能夠引起C2C12細(xì)胞線粒體膜電位的下降，提示細(xì)胞能量