中國(guó)豬鏈球菌2型強(qiáng)致病株體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)基因的篩選研究.pdf

1、1998年及2005年分別在我國(guó)江蘇省和四川省暴發(fā)的兩次大規(guī)模豬鏈球菌2 型(Streptococcus suis 2，S. Suis 2)感染事件，使得豬鏈球菌感染作為一種嚴(yán)重的人獸共患病備受關(guān)注。自1968年丹麥發(fā)現(xiàn)第一個(gè)豬鏈球菌感染病人以來，世界各國(guó)報(bào)道的豬鏈球菌感染人數(shù)已達(dá)200多人，遍及20多個(gè)國(guó)家，死亡率可達(dá)20％-45％。而在1998年及2005年疫情中，感染人數(shù)達(dá)229人，病死率竟高達(dá)60％～80％，并出現(xiàn)了“鏈球菌中毒

2、性休克綜合征”(StreptococcAltoxic shock syndrome, STSS)這一新的臨床類型，提示S. Suis 2 病原體可能較以往有了重要突變，具有了很強(qiáng)的致病能力及體內(nèi)生存能力。但關(guān)于強(qiáng)致病性豬鏈球菌與宿主細(xì)胞相互作用進(jìn)而引起疾病的具體機(jī)制，至今尚未明確。以往關(guān)于豬鏈球菌的研究顯示：莢膜多糖(Capsular polysaccharide，CPS)、溶血素(Suilysin，SLY)、細(xì)胞外因子(Extrace

3、llular Factor，EF)、溶菌酶釋放蛋白(Muramidasereleased protein, MRP)、粘附素(Adhesin)等因子在細(xì)菌的致病過程中發(fā)揮著重要的作用，但這些都難以解釋豬鏈球菌在1998年及2005年兩次疫情中表現(xiàn)出來的不同以往的超強(qiáng)致病能力。
　　 體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)基因(in vivo induced gene，ivi gene)[8]是指一類僅在病原微生物進(jìn)入宿主體內(nèi)后才表達(dá)而在體外生長(zhǎng)時(shí)不表達(dá)的

4、獨(dú)特基因。大量研究表明，ivi gene 往往與病原菌在宿主體內(nèi)的生存和致病密切相關(guān)，有的甚至是病原菌毒力的決定因素，在致病過程中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)也是抗菌藥物、診斷試劑、疫苗設(shè)計(jì)及研究的良好靶標(biāo)?！绑w內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)”(In vivo Induced Antigen Technology, IVIAT)利用已去除針對(duì)體外抗原抗體的患者恢復(fù)期血清從病原微生物基因組表達(dá)文庫(kù)中篩選其ivi gene，不依賴動(dòng)物模型的建立，是目前ivi ge

5、ne 研究的一項(xiàng)重要技術(shù)。本研究中，我們利用IVIAT篩選中國(guó)豬鏈球菌2 型強(qiáng)毒株(05ZYH33)基因組表達(dá)文庫(kù)，尋找其體內(nèi)誘導(dǎo)基因，為深入認(rèn)識(shí)其致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程圖
　　 1.豬鏈球菌感染病人血清的收集與處理：9 份S.suis 2 感染患者恢復(fù)期血清由唐家琪教授惠贈(zèng)，9名患者均為出現(xiàn)典型臨床癥狀的確診病人，挑選效價(jià)較高的8個(gè)病人的血清，等體積混合，加入蛋白酶抑制劑。混合血清分別先用05ZYH33和BL21(DE

6、3)全細(xì)胞體外培養(yǎng)物吸附，再用兩菌的超聲裂解物及熱變性裂解產(chǎn)物進(jìn)行吸附，盡可能去除血清中針對(duì)體外表達(dá)抗原的抗體。每次吸附后吸取5-10ul 血清，采用ELISA 方法(05ZYH33菌株超聲裂解產(chǎn)物為包被抗原)進(jìn)行血清吸附效果評(píng)定。結(jié)果顯示血清經(jīng)多次吸附處理后抗體滴度明顯下降，表明血清中含有的針對(duì)05ZYH33 強(qiáng)致病株體外抗原的抗體越來越少，最后兩次吸附后的OD值無明顯下降，提示血清中針對(duì)05ZYH33株體外表達(dá)抗原的抗體已基本去盡。

7、
　　 2.基因組表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建：用Pet-30a/b/c 載體表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建表達(dá)文庫(kù)。提取05ZYH33基因組DNA，用Sau3AⅠ進(jìn)行不完全酶切，回收0.5～1.5 kb的DNA 片段。純化的DNA 片段與經(jīng)同尾酶BamHⅠ酶切及CIAP 去磷酸化處理的Pet-30a/b/c 載體連接，連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，采用卡那霉素LB平板篩選陽性重組子。隨機(jī)挑選部分陽性克隆提取質(zhì)粒后用XhoⅠ與KpnⅠ行雙酶切鑒定，結(jié)果顯示

8、插入片段大都分布在0.5～1.5kb 范圍之內(nèi)，重組陽性率達(dá)95％，共獲得陽性重組克隆約3.20×104個(gè)，遠(yuǎn)大于理論計(jì)算值，達(dá)到建庫(kù)要求，表明文庫(kù)構(gòu)建成功。
　　 3.基因組表達(dá)文庫(kù)的篩選：采用原位免疫印跡技術(shù)對(duì)表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行篩選：表達(dá)文庫(kù)轉(zhuǎn)化菌液稀釋后均勻涂布kana-LB平板(300～500個(gè)菌落/平板)，37℃培養(yǎng)10h后將菌落影印至滅菌硝酸纖維素膜(NC 膜)上。帶菌NC 膜轉(zhuǎn)移至含kana和IPTG的LB平板37℃誘導(dǎo)

9、培養(yǎng)4 h后，用氯仿蒸汽作用15 min 以裂解細(xì)菌釋放蛋白。NC 膜用10％脫脂奶粉封閉過夜，并依次與吸附血清和辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體，室溫下反應(yīng)1-2 h，用DAB 顯色試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，顯色明顯高于背景者為初篩陽性克隆，以不含插入片段的Pet-30a/b/c 空載體的BL21菌落為陰性對(duì)照，按初篩相同步驟進(jìn)行第二次篩選，重復(fù)兩遍以排除假陽性，最后確定了151個(gè)復(fù)篩陽性克隆，包含了122個(gè)可能的ivi基因。
　　

10、4.RT-PCR 驗(yàn)證：將Todd-Hewitt(TH)培養(yǎng)基培養(yǎng)的豬鏈球菌05ZYH33株，用TRIzol 提取其總RNA，用Rnase-Free Dnase I 處理徹底消除其DNA后，用所篩選的122個(gè)ivi基因設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證，并設(shè)立陽性對(duì)照。凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果顯示，6個(gè)基因有極弱的條帶，為可疑的體內(nèi)誘導(dǎo)基因；19個(gè)基因沒有相應(yīng)的條帶，說明其在體外是沒有表達(dá)的，為體內(nèi)誘導(dǎo)基因。
　　 綜上所述

11、，通過IVIAt技術(shù)的篩選，我們初篩出556個(gè)克隆，通過兩次復(fù)篩得到151個(gè)克隆，其中包括122個(gè)可疑的ivi基因，最后通過RT-PCR 驗(yàn)證最終鑒定出25個(gè)豬鏈球菌2 型的ivi基因，包括5個(gè)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的ivi基因；2個(gè)IV 型分泌系統(tǒng)的ivi基因；1個(gè)毒力因子ivi基因；3個(gè)核酸代謝的ivi基因；3個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)合成的ivi基因；4個(gè)重要代謝途徑的ivi基因；1個(gè)轉(zhuǎn)座酶的ivi基因；1個(gè)DNA 翻譯、轉(zhuǎn)錄的ivi基因及5個(gè)功能未知