超聲微泡介導(dǎo)硫化氫傳輸減輕心肌缺血再灌注損傷的研究.pdf

1、目的：
　?、贅?gòu)建高H2S載量的穩(wěn)定的載硫化氫微泡(hs-MB);②探索hs-MB對(duì)MIRI的作用及可能機(jī)制。
　　方法：
　　1.hs-MB的制備及評(píng)價(jià)
　　由于H2S為小分子氣體，易于溢出微泡，而C3F8為大分子惰性氣體，可增加微泡的穩(wěn)定性，因此，為了制備具有較高穩(wěn)定性和H2S載量的hs-MB，我們探索了H2S和C3F8最佳的混合比例。采用機(jī)械震蕩法制備5種載不同比例的H2S和C3F8混合氣體（分別為4/0、

2、3/1、2/2、1/3、0/4）的超聲微泡，顯微鏡觀察微泡的形態(tài)，測(cè)量微泡中H2S的含量;在不同時(shí)間點(diǎn)(0h、1h、6h、24h、72h)用庫(kù)爾特計(jì)數(shù)儀測(cè)定hs-MB的微泡濃度及粒徑，評(píng)估其穩(wěn)定性。根據(jù)微泡濃度、H2S載量和微泡穩(wěn)定性優(yōu)選出最佳的氣體混合比例。
　　2.超聲輻照hs-MB傳輸H2S的實(shí)驗(yàn)研究
　　①.超聲輻照觸發(fā)hs-MB釋放H2S的體外實(shí)驗(yàn)
　　在體外流動(dòng)腔裝置上，PBS以10ml/min的速度恒速通

3、過(guò)，hs-MB以100μl/min泵入，在其下游用超聲空化治療儀發(fā)射的低頻超聲波（發(fā)射頻率1.0MHz，聲壓1.0MPa）進(jìn)行輻照，液體流出口處采用氣體信號(hào)分子和生物自由基檢測(cè)儀實(shí)時(shí)檢測(cè)液體中H2S濃度。
　?、?超聲破壞hs-MB定位傳輸H2S的在體實(shí)驗(yàn):
　　9只SD大鼠隨機(jī)分成Control、hs-MB和hs-MB+US組。Control組不予處理;hs-MB組經(jīng)尾靜脈6×109個(gè)/(kg·h)泵入hs-MB，持續(xù)30

4、分鐘;hs-MB+US組在泵入hs-MB的同時(shí)低頻超聲輻照心前區(qū)。對(duì)比超聲檢查觀察hs-MB的成像效果及微泡破壞情況。觀察hs-MB對(duì)大鼠血壓心率和呼吸的影響。測(cè)量不同器官組織中H2S的濃度。
　　3.超聲破壞hs-MB減輕MIRI的實(shí)驗(yàn)研究
　　72只SD大鼠隨機(jī)分成4組(n=18):
　?、?SHAM組:不拉緊左冠脈結(jié)扎線，經(jīng)尾靜脈6ml/（kg·h）泵入生理鹽水。
　?、?MIRI組:拉緊左冠脈結(jié)扎線30m

5、in，經(jīng)尾靜脈6ml/(kg·h)泵入生理鹽水。
　　Ⅲ.c-MB+US組:拉緊左冠脈結(jié)扎線30min，經(jīng)尾靜脈6×109個(gè)/(kg·h)泵入普通超聲微泡（全氟丙烷內(nèi)核，c-MB）。低頻超聲輻照大鼠心前區(qū)破壞微泡。
　?、?hs-MB+US組:拉緊左冠脈結(jié)扎線30min，經(jīng)尾靜脈6×109個(gè)/(kg·h)泵入hs-MB。超聲輻照方法和條件與c-MB+US組相同。
　　在缺血心肌再灌注前5分鐘開始給予干預(yù)治療，持續(xù)30分

6、鐘。再灌注4小時(shí)后，每組取6只大鼠分別行H&E染色和TUNEL染色，取另外6只大鼠測(cè)量心肌組織MDA和SOD的濃度。再灌注24小時(shí)，行超聲心動(dòng)圖檢查評(píng)估大鼠心功能后處死大鼠取出心臟行TTC/伊文思藍(lán)雙染色檢測(cè)心肌缺血及梗死面積。
　　4.統(tǒng)計(jì)方法
　　運(yùn)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)值均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析，Bonferroni進(jìn)行組間多重比較。hs-MB穩(wěn)定性的數(shù)

7、據(jù)采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析進(jìn)行比較。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.H2S/C3Fs為2/2制備的hs-MB具有較高的穩(wěn)定性和H2S載量。H2S/C3F8為2/2制備的hs-MB穩(wěn)定性良好，H2S載量最高，微泡濃度為(1.01±0.19)×109/mL，粒徑為2.26±0.17μm，分布于0-9μm。
　　2.超聲輻照觸發(fā)hs-MB釋放H2S。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在輸注hs-MB前，液體中H2S

8、濃度穩(wěn)定維持在0μM水平;加入hs-MB后，H2S濃度稍有增加;若同時(shí)輸注hs-MB和低頻超聲輻照，可觀察到H2S濃度顯著增加并維持在3.5-4.5μM，停止微泡輸注和低頻超聲輻照后，H2S濃度迅速降至基線水平。輸注hs-MB和低頻超聲組液體中H2S濃度最大峰值顯著高于僅輸注hs-MB組(P＜0.05)。
　　3.超聲破壞hs-MB促進(jìn)H2S的定位傳輸。超聲破壞hs-MB定位傳輸H2S的在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:hs-MB具有良好的超聲顯

9、影能力，經(jīng)靜脈注射后可到達(dá)心肌組織并可被低頻超聲破壞。hs-MB+US處理后，大鼠心肌組織和肺臟組織中H2S含量較對(duì)照組升高（均P＜0.05），而腎臟和肝臟組織中H2S含量無(wú)明顯變化(均P＞0.05)。
　　4.hs-MB+US減小心肌梗死面積。與SHAM組相比，MIRI組IS/AAR顯著擴(kuò)大(P＜0.01)。MIRI和c-MB+US組IS/AAR無(wú)顯著差異(P＞0.05)。hs-MB+US組IS/AAR明顯小于c-MB+US組(

10、P＜0.05)。心肌組織H&E染色示hs-MB+US組心肌纖維呈波浪狀排列，肌纖維斷裂程度、間隙水腫和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度較c-MB+US組減輕。
　　5.hs-MB+US改善大鼠MIRI后心功能。與SHAM組相比，MIRI組EDd和ESd顯著增加(P＜0.05)，LVFS和LVEF顯著降低(P＜0.01)。MIRI和c-MB+US組ESd、EDd、LVFS和LVEF無(wú)差異（所有P＞0.05）。與c-MB+US組相比，hs-MB+US

11、組ESd減小(P＜0.05)，LVFS(P＜0.01)和LVEF(P＜0.01)明顯改善，但EDd無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　6.hs-MB+US減輕MIRI后心肌細(xì)胞凋亡。與SHAM組相比，MIRI組凋亡細(xì)胞明顯增加(P＜0.01)。MIRI和c-MB+US組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目無(wú)差異(P＞0.05)。hs-MB+US組凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯少于c-MB+US組(P＜0.01)。
　　7.hs-MB+US減輕MIRI后氧化應(yīng)激

12、。與SHAM組相比，MIRI組心肌組織中MDA含量增加(P＜0.01)，而SOD含量減低(P＜0.01)。MIRI和c-MB+US組心肌組織中MDA和SOD含量無(wú)差異(P＞0.05)。hs-MB+US組心肌組織中MDA含量較c-MB+US組減少(P＜0.05)，而SOD含量增加(P＜0.01)。
　　8.hs-MB+US對(duì)大鼠血流動(dòng)力學(xué)和呼吸的無(wú)影響。
　　結(jié)論：
　　H2S/C3F8為2/2制備的hs-MB具有較高的