TLR4和VDR在2型糖尿病和糖尿病腎病尿毒癥患者單核細(xì)胞的炎癥調(diào)節(jié)作用及1,25-(OH)2D3干預(yù)機(jī)制研究.pdf

1、第一部分:2型糖尿病和糖尿病腎病尿毒癥患者循環(huán)血CD14+CD16+單核細(xì)胞數(shù)及單核細(xì)胞TLR4的表達(dá)研究
　　目的
　　2型糖尿病(T2DM)和糖尿病腎病(DN)尿毒癥患者外周血CD14+CD16+單核細(xì)胞數(shù)和Toll樣受體4(TLR4)在單核細(xì)胞的表達(dá)水平及相關(guān)細(xì)胞因子濃度的差異。
　　方法
　　對22例非DN尿毒癥患者、30例DN尿毒癥患者、28例單純T2DM患者和20例健康志愿者外周血流式細(xì)胞術(shù)檢測CD1

2、4+CD16+單核細(xì)胞數(shù)和TLR4在單核細(xì)胞的表達(dá)，免疫比濁法檢測血清CRP水平，鱟試劑法檢測血清內(nèi)毒素水平，同時ELISA法檢測外周血相關(guān)細(xì)胞因子IL-6和MCP-1的濃度。
　　結(jié)果
　　與正常對照組比較，T2DM組及DN尿毒癥組外周血促炎CD14+CD16+單核細(xì)胞數(shù)及單核細(xì)胞TLR4和血清CRP水平均增高，且DN尿毒癥組CD14+CD16+單核細(xì)胞數(shù)及單核細(xì)胞TLR4和血清CRP水平均較T2DM組顯著增高。但非DN尿

3、毒癥組單核細(xì)胞TLR4表達(dá)較前三組均明顯降低(P<0.01)。非DN尿毒癥組CD14+CD16+單核細(xì)胞數(shù)和血清CRP水平均較DN尿毒癥組稍低，但二者差異不明顯(P>0.05)。四組相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、MCP-1濃度逐漸升高，其中，DN尿毒癥組>非DN尿毒癥組>T2DM組>正常對照組，患者外周血CD14+CD16+單核細(xì)胞數(shù)及血清CRP水平與IL-6和MCP-1濃度呈正相關(guān)。2型糖尿病和尿毒癥患者體內(nèi)內(nèi)毒素水平均較正常對照人群高，尤其

4、以尿毒癥患者濃度升高最明顯(P<0.01)。
　　結(jié)論
　　以上結(jié)果提示在T2DM階段就可能存在促炎CD14+CD16+單核細(xì)胞功能紊亂，這種功能紊亂可能參與了T2DM和DN尿毒癥的發(fā)生發(fā)展。非DN尿毒癥患者也存在單核細(xì)胞功能紊亂，但外周血炎癥相關(guān)因子DN尿毒癥患者較非DN尿毒癥患者水平升高明顯，這可能是DN為何躍升為終末期腎功能衰竭(ESRF)首位病因的原因之一。
　　第二部分:1，25-(OH)2D3的干預(yù)研究

5、r>　　目的
　　探討1，25-(OH)2D3及Toll-like recepter(TLR)4配體，脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)聯(lián)合白介素(IL)-15對2型糖尿病(T2DM)和糖尿病腎病(DN)尿毒癥患者血清干預(yù)的單核細(xì)胞維生素D受體(VDR)、TLR4、TLR9和STAT5、NF-κB信號通路及骨架蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步探索1，25-(OH)ED3在T2DM和DN尿毒癥炎癥性免疫反應(yīng)中的作用及其可能

6、機(jī)制。
　　方法
　　分離研究對象(健康對照組20例、T2DM組28例和DN尿毒癥組30例)外周血血清，孵育THP-1單核細(xì)胞，然后于含或不含1，25-(OH)2D3培養(yǎng)液中培養(yǎng)，再用LPS和IL-15干預(yù)，干預(yù)結(jié)束后收集單核細(xì)胞和培養(yǎng)上清。采用實(shí)時熒光定量PCR檢測VDR、TLR4、TLR9和IL-15的mRNA表達(dá)，Western blot檢測THP-1單核細(xì)胞內(nèi)TLR4、VDR、NF-κB P65、Iκ B、STAT5

7、和p-STAT5蛋白表達(dá)。用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-6和單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1水平，細(xì)胞免疫熒光和激光共聚焦等技術(shù)檢測VDR和骨架蛋白的表達(dá)。然后通過STAT5抑制劑AG490干預(yù)后，檢測LPS、IL-15及1，25-(OH)2D3對T2DM、DN尿毒癥患者血清誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞內(nèi)STAT5磷酸化水平的影響。
　　結(jié)果
　　1.5％濃度的DN尿毒癥患者血清對體外培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，且以12

8、h作用最為顯著，其機(jī)制可能與單核細(xì)胞上的TLR4有關(guān)。
　　2.LPS和IL-15干預(yù)后可下調(diào)T2DM和DN尿毒癥患者血清孵育的單核細(xì)胞內(nèi)VDR和IκB蛋白水平，上調(diào)TLR4、p-STAT5、NF-κB P65和IL-6k MCP-1蛋白及TLR4和IL-15 mRNA水平，細(xì)胞骨架出現(xiàn)重排，各組TLR9 mRNA和STAT5蛋白表達(dá)水平無顯著性差異(P>0.05)，而1，25-(OH)ED3可部分阻斷上述作用，1，25-(OH)

9、2D3提前干預(yù)后三組的VDR和TLR4 mRNA表達(dá)及VDR、NF-κB P65、Iκ B和p-STAT5蛋白表達(dá)，以及相關(guān)炎癥因子水平均無顯著性差異(P>0.05)，細(xì)胞形態(tài)和骨架蛋白分布均正常。
　　3.通過STAT5抑制劑AG490干預(yù)后，與LPS+IL-15組比較，VD3組、AG490+LPS+IL-15組和AG490+VD3組STAT5磷酸化水平均降低，具有顯著性差異(P<0.01)，其中以AG490+VD3組降低最明顯

10、。
　　結(jié)論
　　1，25(OH)ED3的抗炎機(jī)制可能與TLR4、NF-κB P65、VDR和STAT5信號途徑及骨架蛋白有關(guān)。
　　第三部分: VDR和STAT5間的關(guān)系研究
　　目的
　　為了驗(yàn)證VDR和p-STAT5間的相互作用，進(jìn)一步探索1，25-(OH)2D3
　　方法
　　實(shí)驗(yàn)分3組：(1)對照組(2)LPS和IL-15干預(yù)組(3)1，25(OH)2D3提前干預(yù)組。先用免疫熒光對二者

11、進(jìn)行共定位。再用免疫共沉淀技術(shù)檢測VDR和p-STAT5間的相互作用。
　　結(jié)果
　　LPS和IL-15干預(yù)組和1，25(OH)2D3提前干預(yù)組p-STAT5在胞核表達(dá)，較對照組明顯增多，VDR和p-STAT5可結(jié)合在一起，且以1，25(OH)2D3提前干預(yù)組結(jié)合較前兩組顯著增多。
　　結(jié)論
　　單核細(xì)胞內(nèi)VDR和p-STAT5可能存在相互作用。1，25(OH)2D3的抗炎機(jī)制可能是通過STAT5-VDR間的串話