DHV-I抗體乳膠凝集試劑盒的研制和間接ELISA方法的建立.pdf

1、Ⅰ型鴨肝炎病毒(DHV-Ⅰ)引起的鴨病毒性肝炎(DVH)是一種高致病性傳播迅速的疾病，它已經(jīng)成為威脅養(yǎng)鴨業(yè)的主要疾病之一。DHV-Ⅰ主要感染1月齡以下雛鴨，尤其是2周內(nèi)的更易感。免疫接種是預(yù)防和控制鴨肝炎的主要手段。DHV-Ⅰ疫苗通常是通過注射種鴨使其雛鴨獲得被動(dòng)在免疫。為了適應(yīng)不同層次的檢測(cè)需要，本文研究并建立了檢測(cè)DHV-Ⅰ抗體的LAT和間接ELISA兩種方法，以用于監(jiān)控疫苗的免疫效果，指導(dǎo)制訂合理的免疫程序。具體研究成果如下：

2、r>　　 第一，本研究首先通過雞胚繁殖DHV-Ⅰ弱毒并進(jìn)行滅活，然后通過對(duì)比4種不同的純化方法，探索出一種簡(jiǎn)單有效重復(fù)性好且利于大量制備純化病毒的方法--差速超高速離心法，用以制備檢測(cè)DHV-Ⅰ抗體的抗原。純化后的抗原采用磷鎢酸負(fù)染電鏡進(jìn)行觀察、鑒定，結(jié)果表明經(jīng)差速超高速離心后雜蛋白很少，病毒粒子清晰。
　　 第二，制備建立檢測(cè)方法所需的鴨源DHV-Ⅰ陽(yáng)性與陰性血清，并經(jīng)中和試驗(yàn)驗(yàn)證所制DHV-Ⅰ陽(yáng)性血清中和效價(jià)為1:32，陰

3、性血清不具有中和作用。
　　 第三，將經(jīng)過純化滅活后的病毒，作為包被抗原，建立了一種檢測(cè)鴨血清中抗體的間接ELISA方法。通過對(duì)反應(yīng)條件優(yōu)化，確定了各組分的最適工作條件為：抗原包被濃度為1:800(5.56μg/mL)，樣品稀釋濃度為1:256，二抗稀釋濃度為1:3200，陰陽(yáng)性臨界值為0.249。通過對(duì)本方法的評(píng)估及對(duì)1058份樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，本試驗(yàn)建立的間接ELISA方法可用于鴨血清中DHV-Ⅰ抗體的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

4、　　 第四，將經(jīng)過純化滅活的病毒用于致敏聚苯乙烯乳膠，建立了檢測(cè)DHV-Ⅰ抗體的LAT方法。經(jīng)過對(duì)該LAT進(jìn)行優(yōu)化，確定的最佳致敏條件為：致敏溫度37℃，病毒致敏量300μg/mL，致敏時(shí)間2.5h。通過對(duì)本方法的評(píng)估及對(duì)1058份樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，本試驗(yàn)建立的LAT方法可用于血清中DHV-Ⅰ抗體水平的臨床檢測(cè)，并通過試驗(yàn)初步確定其臨床決定水平為“+++”。
　　 第五，為了進(jìn)一步評(píng)估該LAT和間接ELISA方法，將兩者進(jìn)行

5、了一系列的對(duì)比試驗(yàn)。首先，應(yīng)用LAT、間接ELISA、與NT對(duì)來自20羽免疫了四次DHV-Ⅰ的鴨血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果一致符合且表明樣本為陽(yáng)性。其次，使用間接ELISA和LAT分別對(duì)30個(gè)陰性血清樣本和1個(gè)陽(yáng)性血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果兩者均能正確選擇出陽(yáng)性樣本，并均具有較好的選擇性。再次，對(duì)相同40個(gè)血清樣本作倍比稀釋后進(jìn)行的檢測(cè)表明，雖然LAT與ELISA均表明40個(gè)樣本均為陽(yáng)性，但是敏感性方面使用Stata軟件包進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)表明

6、：LAT與ELISA檢測(cè)結(jié)果的Kappa值為-0.012200，這表明兩者敏感性的一致性極差，差異顯著，且由均值可見ELISA更敏感。最后，通過對(duì)相同的1058個(gè)血清樣本進(jìn)行獨(dú)立檢測(cè)結(jié)果表明：與間接ELISA相比，LAT的敏感性為89.1％，特異性92.7%，總符合率為91.4%，Kappa值為0.815200，95%置信區(qū)間為[0.754965，0.875435]，可見兩試驗(yàn)結(jié)果一致性極強(qiáng)。
　　 第六，本文研究的LAT試劑盒