王鴿α-Syn基因克隆及AVM急性中毒對(duì)其在腦組織中表達(dá)的影響.pdf

1、α-突觸核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)是一個(gè)由140個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的酸性蛋白,在腦組織中高度表達(dá),主要聚集在神經(jīng)元突觸前末梢,在神經(jīng)元的發(fā)育與形成、多巴胺合成、保持突觸可塑性及突觸囊泡的運(yùn)輸過程中發(fā)揮重要作用。相對(duì)于哺乳動(dòng)物,禽類α-Syn的研究相對(duì)滯后,而關(guān)于王鴿α-Syn基因序列及其在王鴿腦內(nèi)的分布還未見報(bào)道。
　　 本研究應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)克隆一段覆蓋王鴿α-Syn完整編碼區(qū)的序列;使用DNAMAN和DNA

2、Star軟件對(duì)人、黑猩猩、牛、豬、王鴿、原雞、斑胸草雀及小鼠8種物種α-SyncDNA編碼區(qū)核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),并構(gòu)建生物進(jìn)化樹;利用基因工程技術(shù)在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了α-Syn并制備了多克隆抗體;應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)了王鴿腦組織中α-Syn的分布及阿維菌素(Avermectin,AVM)急性中毒對(duì)王鴿腦組織中α-Syn蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果表明:
　　 1成功克隆了613bp的王鴿α-SyncDNA序列,其中包括ORF4

3、32bp,起始密碼子ATG,終止密碼子TGA,5'UTR區(qū)域16bp,3'UTR區(qū)域165bp,王鴿α-Syn由143個(gè)氨基酸殘基組成,蛋白分子量為14.9kDa。
　　 2王鴿與其他7個(gè)物種α-Syn編碼區(qū)核苷酸序列同源性在81.71/～93.52％之間,與原雞和斑胸草雀同源性最高均為93.52％,與黑猩猩的為83.80％,與人的為83.60％,與豬的為83.56％,與小鼠的為82.87％,與牛的為81.71％,王鴿與其他7種

4、物種α-Syn氨基酸序列的同源性在83.22％～97.20％之間,說明不同物種間α-Syn基因高度保守,提示王鴿與其他已知物種α-Syn的功能相似。
　　 3在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)了pGEX6p-1-α-Syn融合蛋白,制備出兔抗王鴿α-Syn的多克隆抗體,采用間接ELISA檢測(cè)抗體的效價(jià)為1:51200,采用Westernblot檢測(cè)出多克隆抗體對(duì)于融合蛋白具有特異性。
　　 4王鴿海馬、丘腦、嗅球、視葉、小腦5

5、個(gè)部位中均檢測(cè)到α-Syn,含量高低依次為海馬、嗅球、丘腦、視葉和小腦,表明α-Syn在王鴿腦內(nèi)分布廣泛,并且分布具有差異性。
　　 5AVM急性中毒后,王鴿海馬、丘腦、嗅球、視葉和小腦5個(gè)部位中α-Syn蛋白表達(dá)均升高,海馬、丘腦和嗅球的α-Syn表達(dá)與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05),而視葉和小腦與對(duì)照組相比差異不顯著(P＞0.05),表明AVM急性中毒后,腦不同部位α-Syn表達(dá)量的升高具有差異性,提示AVM急性中毒引起