“腦神經(jīng)血管單元”體外模型的成模性研究.pdf

1、背景:
　　 “腦神經(jīng)血管單元”是包括大腦神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞、微血管等在內(nèi)的一個整體概念，在腦神經(jīng)血管疾病的研究和治療中具有重要意義。課題組前期用原代培養(yǎng)的大鼠大腦皮層神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和腦微血管內(nèi)皮細胞，采用Tanswell細胞培養(yǎng)小池，在體外初步建立了“腦神經(jīng)血管單元”整體結(jié)構(gòu)模型，但其方法還不夠穩(wěn)定成熟，對于整體結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)性及其與在體功能的吻合性的驗證還不足。本文的研究是在前期工作基礎(chǔ)上進行方法學(xué)的改進、穩(wěn)定，使其成熟，并

2、驗證其整體結(jié)構(gòu)的相互關(guān)聯(lián)性及其與在體“腦神經(jīng)血管單元”功能的相似性。
　　 本課題獲得了教育部博士學(xué)科點專項基金（博導(dǎo)類:20110182110012）;重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研重大項目（渝中醫(yī)2010160]2010-1-4）的支持。
　　 目的:
　　 1.改進并穩(wěn)定建模用三種細胞的分離培養(yǎng)方法和神經(jīng)血管單元三細胞共培養(yǎng)模型建立方法，為進一步研究提供穩(wěn)定成熟的技術(shù)手段。
　　 2.研究細胞特異性蛋白在缺

3、氧復(fù)氧損傷不同時間點的表達及其相互關(guān)系，驗證體外建立的“腦神經(jīng)血管單元”模型與在體功能的相似性。
　　 方法:
　　 1.建模用三種大鼠腦細胞分離、培養(yǎng)與純化鑒定方法的改進和穩(wěn)定
　　 建立大鼠腦皮層微血管內(nèi)皮細胞分離、培養(yǎng)與純化鑒定新方法本研究直接將25％的BSA加入獲取的皮質(zhì)層碎塊中，勻漿后梯度離心取微血管段，用0.1％的Ⅱ型膠原酶消化獲取微血管內(nèi)皮細胞，用含20％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，不添加

4、生長因子，在傳代時通過差異消化法純化，用兔抗Ⅷ因子進行鑒定。
　　 大鼠腦皮層神經(jīng)元細胞分離、培養(yǎng)、純化與鑒定方法的改進改進課題組前期用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，用阿糖胞苷抑制非神經(jīng)元細胞生長來純化，用神經(jīng)元特異烯醇化酶(NSE)進行鑒定的方法;本研究中，采用DMEM/F12培養(yǎng)基添加無血清B27進行培養(yǎng)與純化，用神經(jīng)元特異性微管相關(guān)蛋白質(zhì)2(MAP-2)進行鑒定。
　　 大鼠腦皮層星形膠質(zhì)細胞分離、培養(yǎng)

5、與純化鑒定方法的穩(wěn)定方法同課題組前期方法:分離新生3d內(nèi)大鼠皮質(zhì)層星形膠質(zhì)細胞，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過搖瓶去除非星形膠質(zhì)細胞，用兔抗GFAP鑒定。
　　 2.“腦神經(jīng)血管單元”體外共培養(yǎng)模型建立方法的改進與穩(wěn)定
　　 改變前期選用半透明transwell培養(yǎng)小池，神經(jīng)元培養(yǎng)傳代后接種到培養(yǎng)孔底，0.4mL/孔星形膠質(zhì)細胞混懸液接種，培養(yǎng)2天后接種微血管內(nèi)皮細胞的方法。本研究選用透明的tran

6、swell培養(yǎng)小池，神經(jīng)元直接接種在培養(yǎng)板孔底培養(yǎng)純化，在transwell膜外側(cè)種植lmL的星形膠質(zhì)細胞混懸液，貼壁后將小池插入神經(jīng)元培養(yǎng)孔，1d后在transwell膜內(nèi)側(cè)種植純化的腦微血管內(nèi)皮細胞，共培養(yǎng)3d后用于模型評價和相關(guān)實驗。通過倒置相差顯微鏡觀察三種細胞生長狀態(tài)、檢測4小時滲漏試驗和跨內(nèi)皮細胞電阻值，評價模型構(gòu)建成功與否，評價正常培養(yǎng)時，該模型屏障功能與在體生理條件下的相似性。
　　 3.“腦神經(jīng)血管單元”體外共

7、培養(yǎng)模型氧復(fù)氧損傷方法的建立與穩(wěn)定
　　 將建模成功的培養(yǎng)池內(nèi)培養(yǎng)基換成無血清缺氧液，放入持續(xù)通入混合氣體的、37℃恒溫恒濕的缺氧裝置中處理4h，再將缺氧液換成復(fù)氧液，于正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。通過倒置相差顯微鏡觀察模型中三種細胞生長狀態(tài)、檢測4小時滲漏試驗和跨內(nèi)皮細胞電阻值，評價模型缺氧復(fù)氧損傷的成功與否;評價缺氧復(fù)氧損傷后，該模型屏障功能變化與在體病理條件下的相似性。
　　 4.“腦神經(jīng)血管單元”體外模型缺氧復(fù)氧損傷中細

8、胞特異性蛋白動態(tài)變化研究
　　 在缺氧前、復(fù)氧0h、復(fù)氧2h、復(fù)氧6h、復(fù)氧12h及復(fù)氧24h六個時間點分別提取不同培養(yǎng)方式下三種細胞蛋白，經(jīng)過前處理后用WB方法檢測神經(jīng)元GAP-43、微血管內(nèi)皮細胞Claudin-5、星形膠質(zhì)細胞AQP-4的表達。通過比較上述功能蛋白在缺氧復(fù)氧損傷時表達變化與在體缺血再灌注損傷過程中表達變化，評價缺氧復(fù)氧損傷后，該模型中細胞功能變化與在體病理條件下的相似性。
　　 結(jié)果:
　　

9、 1.方法改進后，分離培養(yǎng)的三種建模用新生大鼠腦原代培養(yǎng)細胞形態(tài)均一，呈現(xiàn)出各自典型的生長特征。經(jīng)特異性蛋白鑒定，神經(jīng)元純度達95％以上，較改進前提高10％;星形膠質(zhì)細胞純度達96％以上，較改進前提高6％;微血管內(nèi)皮細胞純度達99％以上，較改進前提高4％。改進后的腦微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)方法操作簡單，耗時短，不需添加昂貴的生長因子，且節(jié)約動物使用量。
　　 2.本研究采用透明transwell膜來改進了課題組前期用半透明transw

10、ell膜建立三細胞共培養(yǎng)模型的方法，并優(yōu)化建模中細胞種植時間、數(shù)量等條件，建立了穩(wěn)定的三細胞共培養(yǎng)模型，不僅使建模時間縮短，而且便于直接觀察細胞生長狀態(tài)和拍照。三細胞共培養(yǎng)體中，細胞共生長良好，星形膠質(zhì)細胞胞體粗大并充分伸展、微血管內(nèi)皮細胞形成單層、神經(jīng)元軸突形成致密的網(wǎng)絡(luò)，基本符合在體生長形態(tài)。通過比較單細胞培養(yǎng)、雙細胞共培養(yǎng)和三細胞共培養(yǎng)生長結(jié)果，表明三細胞共培養(yǎng)模型細胞之間具有明顯的相互促進生長的整體協(xié)同效應(yīng)。4小時滲漏試驗中各孔

11、液面均無明顯下降，跨內(nèi)皮細胞電阻值達到268.3±6.5(Ωcm2)。表明該模型具有“腦神經(jīng)血管單元”中基本的屏障功能，相似于在體“腦神經(jīng)血管單元”的部分生理功能。
　　 3.缺氧復(fù)氧損傷后，三種細胞形態(tài)變化較大。腦微血管內(nèi)皮細胞和星形膠質(zhì)細胞均不同程度出現(xiàn)胞體回縮，細胞間隙增加，神經(jīng)元突觸縮短并減少，但三細胞共培養(yǎng)模型中細胞形態(tài)受損程度小于雙細胞共培養(yǎng)和單細胞培養(yǎng)。顯示三細胞共培養(yǎng)體缺氧復(fù)氧損傷后，與在體腦組織缺血再灌注損傷后

12、細胞形態(tài)變化相似，而且較單細胞或雙細胞培養(yǎng)具有更強的抗損傷能力。與損傷前相比:三細胞共培養(yǎng)體4小時滲漏試驗降低顯著(P＜0.01)?？鐑?nèi)皮細胞電阻值為227.1±3.3(Ωcm2)，下降明顯(P＜0.01)。顯示缺氧復(fù)氧損傷后。該三細胞共培養(yǎng)模型具有相似于在體“腦神經(jīng)血管單元”缺血再灌注損傷的細胞病理變化。
　　 4.雙細胞共培養(yǎng)和單細胞培養(yǎng)時，神經(jīng)元GAP-43和微血管內(nèi)皮細胞Claudin-5的表達在復(fù)氧后0-2小時就極顯著

13、降低(P＜0.001);三細胞共培養(yǎng)體中，神經(jīng)元GAP-43在復(fù)氧后6小時才開始明顯降低(P＜0.05)，該兩種蛋白在復(fù)氧后12小時才達到極顯著降低(P＜0.001)。雙細胞共培養(yǎng)和單細胞培養(yǎng)時，星形膠質(zhì)細胞AQP-4的表達在復(fù)氧后0-2小時就極顯著升高(P＜0.001);在三細胞共培養(yǎng)體中，其表達在復(fù)氧后2小時才顯著升高(P＜0.05)，在復(fù)氧24小時時才達到極顯著升高(P＜0.001)。顯示缺氧復(fù)氧損傷后，三細胞共培養(yǎng)體與在體腦組織

14、缺血再灌注損傷后細胞蛋白變化相似，而且較單細胞或雙細胞培養(yǎng)具有更強的抗損傷能力。該三細胞共培養(yǎng)模型具有相似于在體“腦神經(jīng)血管單元”缺血再灌注損傷的細胞蛋白病理變化。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究建立了一種新的大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng)方法，改進了大鼠腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法，穩(wěn)定了大鼠腦皮層星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)方法。所獲得的大鼠腦皮層三種原代細胞純度較高，為后續(xù)研究提供了穩(wěn)定的細胞培養(yǎng)方法，也可作為相關(guān)研究細胞培養(yǎng)的

15、技術(shù)參考。
　　 2.本研究改進并穩(wěn)定了“腦神經(jīng)血管單元”體外模型建模方法，使建模時間縮短，且便于直接觀察細胞生長狀態(tài)和拍照。所建模型中的三種腦細胞具有類似于在體腦組織細胞之間相互促進生長的作用，具有生理屏障功能。顯示所建立的模型具有與在體“腦神經(jīng)血管單元”相似的部分生理功能。
　　 3.本研究建立了穩(wěn)定的“腦神經(jīng)血管單元”體外模型缺氧復(fù)氧損傷方法。該方法損傷后，“腦神經(jīng)血管單元”體外模型具有相似于在體腦組織細胞的病理形

16、態(tài)學(xué)變化特點。該方法損傷后“腦神經(jīng)血管單元”體外模型中神經(jīng)元GAP-43、微血管內(nèi)皮細胞Claudin-5和星形膠質(zhì)細胞AQP-4的表達，具有類似于在體缺血再灌注損傷后腦組織細胞蛋白的變化特點。
　　 4.與單細胞培養(yǎng)或者雙細胞培養(yǎng)比較，三細胞共培養(yǎng)模型細胞之間具有明顯的相互促進生長的整體協(xié)同效應(yīng)?！澳X神經(jīng)血管單元”體外模型中細胞在缺氧復(fù)氧損傷條件下，更加具有類似于在體腦組織細胞之間相互保護、增強抵御損傷能力的作用。