線粒體靶向-熒光多功能納米平臺(tái)和膠束的制備及其生物醫(yī)用研究.pdf

1、惡性腫瘤，即癌癥，是21世紀(jì)威脅人類健康和生命的最嚴(yán)重疾病之一。迄今癌癥治療尚未取得重大突破，其原因主要有三:化療藥物的高毒副作用、腫瘤的轉(zhuǎn)移和患者的耐藥性。傳統(tǒng)的治療癌癥的方法主要有手術(shù)、化療和放療等，其中化療是癌癥綜合治療時(shí)的常用手段。但是化療的療效一直不佳，原因在于化療藥物通常由注射給藥進(jìn)入人體血液，藥物在到達(dá)腫瘤組織之前經(jīng)過(guò)蛋白結(jié)合、代謝、排泄等諸多過(guò)程之后，血藥濃度很快下降，最終到達(dá)腫瘤病灶部位的藥物非常有限;欲提高腫瘤組織中

2、的化療藥物的濃度就必須加大用藥劑量，但這同時(shí)也會(huì)增大化療藥物對(duì)正常組織器官的毒副作用。此外，化療藥物大多缺乏專一性，患者在用藥期間容易產(chǎn)生多藥耐藥性(MDR)，導(dǎo)致癌癥治療的難度加大。針對(duì)上述問(wèn)題，“靶向治療”的概念應(yīng)運(yùn)而生，靶向治療的核心目的是增加治療部位的藥物濃度、減少藥物的毒副作用，提高藥物的安全性和治療效率。線粒體是細(xì)胞內(nèi)最重要的細(xì)胞器之一，不但含有遺傳物質(zhì)(線粒體DNA)，而且供給真核細(xì)胞代謝所需能量，此外，線粒體應(yīng)激氧化或受

3、損還可能激活和調(diào)控細(xì)胞凋亡通路。因此，線粒體被認(rèn)為是治療癌癥及其他線粒體相關(guān)疾病最有效的靶點(diǎn)之一。納米材料和納米科技的飛速發(fā)展為癌癥的靶向治療提供了新材料和新手段。在本文中，我們合成了帶線粒體靶向基團(tuán)的多功能納米粒子，并且將具有優(yōu)良生物相容性的熒光碳量子點(diǎn)與之相結(jié)合，構(gòu)建并制備了集線粒體靶向和顯影示蹤等多功能為一體的納米平臺(tái);此外，利用納米自組裝與生物共軛技術(shù)，將抗癌藥物負(fù)載到具有線粒體靶向/熒光多功能的納米膠束上，用于逆轉(zhuǎn)腫瘤的MDR

4、。本研究主要內(nèi)容包括：
　　⑴以天然產(chǎn)物大蒜為碳源，通過(guò)熱解、乙醇提取、超純水純化等過(guò)程得到氮、硫元素共摻雜的碳量子點(diǎn)(g-CQDs)。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)：g-CQDs的含氮量為6.46％，含硫量為0.34％，粒徑為5.28 nm，其內(nèi)核具有類石墨化的晶格結(jié)構(gòu)；以硫酸喹啉為參比，g-CQDs在水中的熒光量子產(chǎn)率達(dá)到13.76％；g-CQDs在乙醇和水中的熒光發(fā)射光譜具有激發(fā)光波長(zhǎng)依賴性；g-CQDs具有良好的pH穩(wěn)定性，在pH2-12的

5、范圍內(nèi)g-CQDs水分散液的熒光強(qiáng)度基本沒(méi)有變化；g-CQDs的熒光發(fā)射還表現(xiàn)出溶劑依賴性，在介電常數(shù)較高的溶劑中表現(xiàn)出更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度；g-CQDs對(duì)Fe3+具有高度選擇性，濃度為0.5 mM的Fe3+水溶液能夠使g-CQDs的熒光猝滅至10％以下。我們選取人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)為模型，采用MTT法檢測(cè)g-CQDs的細(xì)胞毒性，結(jié)果表明;當(dāng)g-CQDs的濃度達(dá)到400μg/mL時(shí)細(xì)胞存活率仍在80

6、％以上。然后，我們?cè)贛CF-7和SH-SY5Y的二維(2D)平面細(xì)胞和三維(3D)多細(xì)胞球體(MCs)中觀察了g-CQDs的顯影效果，激光共聚焦顯微鏡(CLSM)測(cè)試結(jié)果表明，在405nm的光激發(fā)下，g-CQDs在2D和3D細(xì)胞模型中均發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光，呈現(xiàn)較好的細(xì)胞成像效果。
　?、埔运疅岱ㄖ苽涞某槾判运难趸F納米晶為核，通過(guò)st(o)ber法包覆介孔二氧化硅殼層，然后在殼層表面修飾具有線粒體靶向功能的三苯基膦分子(TPP

7、)，再進(jìn)一步與魔芋粉熱解得到的氮摻雜的碳量子點(diǎn)(N-CDs)發(fā)生共軛，構(gòu)建一個(gè)集線粒體靶向性、長(zhǎng)時(shí)熒光顯影功能及磁響應(yīng)性的多功能納米平臺(tái)(Fe3O4@mSiO2-TPP/CDs)。通過(guò)透射電子顯微鏡、綜合物性測(cè)量系統(tǒng)、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)和熒光光譜儀等表征手段，發(fā)現(xiàn)該納米平臺(tái)呈均一的核-殼結(jié)構(gòu)，平均粒徑約為43nm，室溫下呈現(xiàn)為超順磁性且具有和N-CDs相似的熒光性能。我們通過(guò)熱失重曲線分析，發(fā)現(xiàn)修飾到Fe3O4@mSiO2上的靶向分子

8、TPP以及N-CDs分別占材料質(zhì)量百分比為12.18％和1.76％。此外，F(xiàn)e3O4@mSiO2-TPP納米粒子帶正電(其Zeta電位值為+33.47 mV)，N-CDs在水溶液中帶負(fù)電(其Zeta電位值為-21.76 mV)，當(dāng)前者與后者共軛之后Zeta電位值下降至+16.33 mV，但激光動(dòng)態(tài)光散射(DLS)檢測(cè)結(jié)果顯示粒子的流體力學(xué)半徑卻隨之增大，證明我們成功地構(gòu)建了線粒體靶向/熒光多功能納米平臺(tái)Fe3O4@mSiO2-TPP/C

9、Ds。
　?、沁x取人肺腺癌細(xì)胞(A549)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、SH-SY5Y、原代人包皮成纖維細(xì)胞(HFF)和人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC-1)為模型，對(duì)Fe3O4@mSiO2-TPP/CDs納米平臺(tái)進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)，結(jié)果表明該納米平臺(tái)沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性，也基本不會(huì)引起細(xì)胞凋亡。將Fe3O4@mSiO2-TPP/CDs分別與上述6種細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，在不同波長(zhǎng)的激光通道下分別呈現(xiàn)出穩(wěn)定、明亮的藍(lán)

10、色、綠色和紅色熒光，表明該納米平臺(tái)具有多色長(zhǎng)時(shí)顯影的功能。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡(CLSM)、流式細(xì)胞儀和細(xì)胞切片的透射電鏡檢測(cè)手段表明:與不具有靶向性的Fe3O4@mSiO2納米粒子相比，F(xiàn)e3O4@mSiO2-TPP能夠更好地與線粒體染料Mitotracker Red共定位于細(xì)胞線粒體。我們還利用CLSM的Z軸掃描技術(shù)排除了納米顆粒是粘附在細(xì)胞表面發(fā)出熒光的可能，證明Fe3O4@mSiO2-TPP確實(shí)進(jìn)入了HFF細(xì)胞，富集在線粒體部位

11、。此外，我們還研究了外加靜態(tài)小磁場(chǎng)（0.3 T)對(duì)細(xì)胞攝取該納米平臺(tái)的影響，結(jié)果表明當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間在1小時(shí)之內(nèi)時(shí)，外加磁場(chǎng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)吞Fe3O4@mSiO2-TPP納米粒子有明顯的增強(qiáng)作用。
　?、壤肈CC/DMAP偶聯(lián)技術(shù)在一種非離子表面活性劑D-α-維生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)末端修飾上線粒體靶向基團(tuán)TPP，然后將TPGS-TPP和HDA包覆的碳量子點(diǎn)(CQDs)自組裝形成納米膠束CQDs-TPGS-TPP。通過(guò)TEM和

12、DLS等表征手段，發(fā)現(xiàn)CQDs-TPGS-TPP自組裝后可以形成單層直徑約100 nm的納米膠束，也可以形成直徑更大的嵌套囊泡。我們將CQDs-TPGS-TPP納米膠束分別與MCF-7細(xì)胞和耐藥型MCF-7/ADR細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，結(jié)果表明該納米膠束的細(xì)胞毒性很小。進(jìn)一步研究表明該納米膠束不僅具有線粒體靶向性，而且因組裝了熒光CQDs可直接用于細(xì)胞成像。此外，構(gòu)成該膠束的主要成分TPGS自身能夠抑制P-g

13、p蛋白的表達(dá)、減少細(xì)胞胞漿內(nèi)藥物的泵出，是一種MDR逆轉(zhuǎn)試劑。因此，我們用CQDs-TPGS-TPP納米膠束負(fù)載抗腫瘤藥物阿霉素(DOX)，由體外載藥和釋藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，該納米膠束對(duì)DOX的負(fù)載率可達(dá)到3.4％，而且載藥納米膠束可以在弱酸性環(huán)境下緩慢釋放所載的DOX。將載藥納米膠束CQDs-TPGS-TPP/DOX與MCF-7/ADR細(xì)胞一起共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與等當(dāng)量濃度的游離DOX原藥相比，載藥納米膠束對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷

14、力。進(jìn)而，采用MCF-7和MCF-7/ADR的3D MCs進(jìn)行滲透實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明:與游離的DOX原藥相比，CQDs-TPGS-TPP能夠幫助運(yùn)送更多的DOX進(jìn)入MCs內(nèi)部，達(dá)到較為理想的滲透效果。而且，在MCF-7/ADRMCs中，與等當(dāng)量的游離DOX原藥相比，載藥納米膠束CQDs-TPGS-TPP/DOX能夠更有效地殺傷MCF-7/ADR細(xì)胞，抑制MCF-7/ADR MCs的生長(zhǎng)。上述結(jié)果表明CQDs-TPGS-TPP納米膠束在一定程