雷公藤多苷聯(lián)合人參皂苷對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響及骨免疫學(xué)機(jī)制探討.pdf

1、目的：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性炎癥性疾病，其病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，主要侵犯滑膜組織，可導(dǎo)致進(jìn)行性關(guān)節(jié)破壞。以TNF-α抑制劑為代表的生物制劑是近年來(lái)RA治療學(xué)的重要進(jìn)展，為RA的治療提供了新的靶向治療選擇。但生物制劑并不能完全控制RA病情進(jìn)展，臨床緩解率仍不理想。同時(shí)，由于價(jià)格昂貴及可能出現(xiàn)嚴(yán)重不良事件，臨床應(yīng)用受到一定限制。近年研究提示植物藥有效成分可能對(duì)RA骨破壞有治療作用。本課題擬

2、通過建立膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型，采用流式細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells，Treg)，ELISA法檢測(cè)血清白介素-10(Interleukin-10，IL-10)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforminggrowth factorβ1，TGF-β1)、白介素-17(Interleukin-17，IL-17)

3、含量，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)關(guān)節(jié)組織IL-10、TGF-β1與MMP3表達(dá)，探討RA骨破壞的部分骨免疫學(xué)機(jī)制，同時(shí)觀察植物藥雷公藤多苷加人參皂苷配伍對(duì)實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎炎癥評(píng)分及骨破壞相關(guān)因素的影響，為傳統(tǒng)中藥有效成分配伍治療RA提供依據(jù)。
　　方法：選擇體重150—180g的Wistar大鼠，雌雄各半。電子稱重，測(cè)量雙側(cè)足爪厚度，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和CIA造模組(實(shí)驗(yàn)組)。實(shí)驗(yàn)組大鼠于尾根部、右足跖及背部多處皮內(nèi)注射雞Ⅱ型膠原共0.2ml

4、/只，笫14d加強(qiáng)免疫建立CIA模型。正常對(duì)照組用同樣方法注入等量生理鹽水。造模后笫21d將成模大鼠隨機(jī)分為模型組、雷公藤多苷組(TG)、TG＋人參皂苷組(GS)、甲胺蝶呤組(MTX)，每組8只。正常對(duì)照組和模型組予生理鹽水灌胃，其他組分別給予TG、TG+GS、MTX灌胃治療，共21d。造模后第42d測(cè)量各組大鼠體重、足爪厚度及關(guān)節(jié)炎指數(shù)；然后眼眶采血，抗疑，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，采用流式細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)Treg。10％水合氯醛腹腔麻醉，

5、腹主動(dòng)脈取血留取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)血清TGF-β1、IL-10、IL-17水平。同時(shí)取雙側(cè)踝關(guān)節(jié)，經(jīng)固定、脫鈣、常規(guī)梯度脫水、浸蠟、包埋、切片。HE染色后光鏡下觀察組織切片病理改變；免疫組化法檢測(cè)踝關(guān)節(jié)滑膜組織TGF-β1、IL-10、MMP-3的表達(dá)并進(jìn)行半定量分析。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所得結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X-±s)表示。各組間均數(shù)比較采用單因素方差分

6、析(one-way ANOVA)，采用LSD法進(jìn)行組間兩兩比較。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)。均以P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.各組大鼠一般情況的觀察比較造模前各組體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模后第21天，各組大鼠體重(g)分別為正常組186.88±5.87、模型組175.63±5.48、TG組175.64±6.30、TG+GS組180.00±6.41、MTX組176.88±7.94

7、；模型組、TG組、TG+GS組、MTX組大鼠體重明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但模型組、TG組、TG+GS組、MTX組組間體重比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。給藥3周后，各組大鼠體重(g)分別為正常組207.88±6.98、模型組181.88±4.76、TG組185.88±5.11、TG+GS組199.50±5.40、MTX組188.25±7.36；模型組、TG組、TG+GS組、MTX組的大鼠體重低于正常組，差異有

8、顯著性(P<0.01)。與模型組相比，TG+GS組和MTX組大鼠體重差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)：但TG+GS組體重明顯高于MTX組，差異有顯著性(P<0.01)。
　　造模后第21天，與正常組大鼠體重增加值(g)23.50±8.12相比，模型組13.50±7.29、TG組10.00±3.59、TG+GS組15.25±9.48、MTX組12.63±9.23差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)：與模型組相比，TG組、TG+GS組、M

9、TX組體重增加值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模后第42天，與模型紕6.25±2.43相比，TG+GS組19.50±4.24、MTX組11.38±3.07體重增加值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TG組10.25±5.23體重增加值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　2.各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的變化隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，除正常對(duì)照組，各組大鼠關(guān)節(jié)紅腫逐漸加重，關(guān)節(jié)炎折數(shù)逐漸增高。造模后第21滅，與模型組9.88±0.83相比

10、，TG組9.63±1.06、TG+GS組9.87±1.25、MTX組9.25±1.04關(guān)節(jié)炎指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模后第42天，與模型組10.00±1.31相比，TG組4.88±1.13、TG+GS組4.75±1.49、MTX組4.63±1.06關(guān)節(jié)炎指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；TG+GS組關(guān)節(jié)指數(shù)高于MTX組，但二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　3.各組大鼠雙足爪腫脹抑制率的變化灌胃結(jié)束后造

11、模側(cè)(右足)平均腫脹率(％)分別為：模型組51.75±7.27、TG組47.13±7.88、TG+GS組34.88±9.33、MTX組35.88±11.09，與模型組相比，TG+GS組、MTX組右足腫脹率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與MTX組相比，TG+GS組對(duì)造模側(cè)足爪腫脹的腫脹抑制率較好，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TG組對(duì)造模側(cè)足爪腫脹的抑制率較差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。澄胃結(jié)束后非造模側(cè)(左足)平均腫脹

12、率(％)分別為模型組52.25±7.15、TG組47.75±7.48、TG+GS組36.50±8.05、MTX組35.38±10.80，與模型組相比，TG+GS組、MTX組右足腫脹率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)：與MTX組相比，TG+GS組對(duì)造模側(cè)足爪腫脹的抑制率較好，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TG組對(duì)造模側(cè)足爪腫脹的抑制率較差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　4.各組大鼠PBMC中Treg的變化各組大鼠PB

13、MC中CD4+CD25+Tregs細(xì)胞百分比分別為：正常組9.08±0.21、模型組5.38±0.27、TG組7.93±0.17、TG+GS組8.26±0.28、MTX組8.19±0.24，與正常組相比，模型組、TG組、TG+GS組、MTX組CD4+CD25+Tregs細(xì)胞百分比值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，TG組、TG+GS組、MTX組CD4+CD25+Tregs細(xì)胞百分比值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)：與

14、MTX組相比，TG+GS組CD4+CD25+Tregs細(xì)胞百分比值較高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TG組CD4+CD25+Tregs細(xì)胞酉分比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組大鼠CD4+CD25+Foxp3+Tregs細(xì)胞百分比分別為：正常對(duì)照組4.59±0.58、模型組2.71±0.20、TG組3.80±0.32、TG+GS組4.46±0.40、MTX組4.18±0.25，與正常對(duì)照組相比，模型組、TG組、MTX組C

15、D4+CD25+Toxp3+Tregs細(xì)胞百分比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TG+GS組CD4+CD25+Foxp3+Tregs細(xì)胞百分比值較正常組低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)：與模型組相比，TG組、TG+GS組、MTX組CD4+CD25+Foxp3+Tregs細(xì)胞百分比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與MTX組相比，TG+GS組CD4+CD25+Foxp3+Tregs細(xì)胞百分比值較高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05

16、)、TG組組CD4+CD25+Foxp3+Tregs細(xì)胞百分比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　5.各組大鼠血清TGF-β1、IL-10、TL-17的變化
　　5.1 血清TGF-β1(pg/ml)水平比較與正常組(609.86±100.93)相比，模型組(412.64±87.26)TGF-β1水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，TG組(518.684±152.93)、TG+GS組(596.60±148.59)、M

17、TX組(587.45±107.06)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組相比，TG+GS組、MTX組TGF-β1水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。TG+GS組TGF-β1水平高于MTX組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　5.2 血清IL-10(pg/ml)水平比較與正常組(54.92±8.81)相比，模型組(37.88±12.14)、TG組(40.60±11.45)IL-10水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

18、，TG+GS組(51.28±11.58)、MTX組(49.35±14.59)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組相比，TG+GS組IL-10水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TG組和MTX組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　5.3 血清IL-17(pg/ml)水平比較與正常組(31.24±9.20)相比，模型組(52.48±17.07)IL-17水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，TG組(42.67±11.26)

19、、TG+GS組(37.77±10.60)、MTX組(38.52±15.49)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組相比，TG+GS組、MTX組IL-17水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TG+GS組IL-17水平低于MTX組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　5.4 外周血Treg細(xì)胞水平與血清TGF-β1、IL-10、IL-17和關(guān)節(jié)炎病理積分的相關(guān)性Treg與TGF-β1、IL-10存在正相關(guān)關(guān)系(r＝0.48

20、8，0.425，P<0.01)，Treg與IL-17和關(guān)節(jié)炎病理評(píng)分存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(r＝0.423，-0.360，P<0.05)。
　　6.各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理變化病理結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠踝關(guān)節(jié)未見明顯病變。模型組大鼠滑膜細(xì)胞增生，滑膜組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜襯里層增厚：滑膜與軟骨連區(qū)域滑膜細(xì)胞增生，軟骨損傷；骨小梁變細(xì)，軟骨下骨和小梁骨出現(xiàn)骨侵蝕，破壞嚴(yán)重。各用藥組病理改變較模型組輕。與模型組(2.00±0.76)相比，TG+GS

21、組(1.00±0.76)、MTX組(1.13±0.83)病理積分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TG組(1.25±0.71)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　7.各組大鼠踝關(guān)節(jié)TGF-β1、IL-10、MMP-3表達(dá)的變化與正常組(0.18±0.02)相比，模型組(0.30±0.03)、TG組(0.22±0.04)關(guān)節(jié)滑組織中TGF-β1表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TG+GS組(0.19±0.03)、MTX組(0

22、.20±0.04)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TG+GS組TGF-β1表達(dá)最少，但與MTX組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常組(0.23±0.04)相比，模型組(0.11±0.01)、TG組(0.13±0.04)、MTX組(0.17±0.05)關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-10表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，TG+GS組(0.20±0.03)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TG+GS組IL-10表達(dá)最多，但與MTX組相比

23、差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常組(0.28±0.07)相比，模型組(0.77±0.06)、TG組(0.60±0.12)、TG+GS組(0.50±0.12)、MTX組(0.46±0.09)關(guān)節(jié)軟骨中MMP-3表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。MTX組MMP-3表達(dá)最少，但與TG+GS組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg與血清TGF

24、-β1、IL-10水平存在正相關(guān)關(guān)系，與血清IL-17、關(guān)節(jié)炎病理積分存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，CD4+CD25+Foxp3+Treg通過上調(diào)血清TGF-β1、IL-10的水平增強(qiáng)其免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨破壞具有保護(hù)作用。
　　2.雷公藤多苷聯(lián)合人參皂苷可能通過升高CD4+CD25+Foxp3+Treg、TGF-β1、IL-10，降低IL-17水平，減少滑膜組織中TGF-β1關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-3的表達(dá)，增強(qiáng)滑膜組織中IL-10表