抗菌肽17BIPHE2抑制金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌生物被膜作用的研究.pdf

1、目的：
　　研究抗菌肽17BIPHE2單獨使用及聯(lián)合抗生素對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)生物被膜的抑制作用，并初步探討抗菌肽17BIPHE2作用細菌后對生物被膜相關基因轉錄水平的影響，為治療金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌生物被膜相關感染及藥物研發(fā)提供了一個新思路。
　　方法：
　　1.采用剛果紅平板測試法（金黃色葡萄

2、球菌）和結晶紫染色法評估受試菌形成生物被膜的能力；
　　2.微量肉湯稀釋法和瓊脂平板測試法測定金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)；
　　3.利用生物被膜早期黏附實驗觀察17BIPHE2單獨使用及聯(lián)合抗生素對生物被膜黏附階段的影響；
　　4.利用生物被膜形成抑制實驗觀察17BIPHE2單獨使用及聯(lián)合抗生素對生物被膜形成階段的影響；
　　5.通過掃描電子顯微鏡(SEM)觀察17

3、BIPHE2單獨使用及聯(lián)合抗生素是否具有清除成熟階段生物被膜的作用；
　　6.采用激光共聚焦激光掃描顯微鏡（LSCM）觀察17BIPHE2是否具有殺傷成熟銅綠假單胞菌生物被膜內(nèi)細菌的作用；
　　7.利用Real-Time PCR分析17BIPHE2作用細菌后對生物被膜相關基因轉錄水平的影響。
　　結果：
　　1.經(jīng)剛果紅平板測試法和結晶紫染色法評估臨床分離株SA05具有較強形成生物被膜能力，臨床分離株SA07不具

4、有形成生物被膜的能力；經(jīng)結晶紫染色法評估臨床分離株PA03具有較強的形成生物被膜能力，臨床分離株PA07不具有形成生物被膜的能力；
　　2.17BIPHE2對金黃色葡萄球菌MIC值為8μmol/L，1/2×MIC就可以有效抑制浮游菌的生長。17BIPHE2對銅綠假單胞菌MIC值為48μmol/L，亞抑菌濃度也可以有效抑制浮游菌的生長。17BIPHE2聯(lián)合抗生素使用較單一使用MIC值均有所下降；
　　3.單獨使用17BIPHE

5、2在金黃色葡萄球菌黏附階段抑制率為40%，17BIPHE2聯(lián)合抗生素使用較單獨使用抗生素其抑制效果有所提升。單獨使用17BIPHE2在銅綠假單胞菌黏附階段抑制率為60%，17BIPHE2聯(lián)合抗生素使用與上述結果相似，較單獨使用抗生素抑制率有所提高；
　　4.在金黃色葡萄球菌生物被膜形成階段17BIPHE2單獨使用抑制率達到35%，而在銅綠假單胞菌生物被膜形成階段17BIPHE2單獨使用抑制率達到80%。值得注意的是，17BIPHE

6、2在1/4×MIC也可以顯著抑制兩種細菌產(chǎn)生生物被膜。17BIPHE2聯(lián)合抗生素結果顯示較單獨使用抗生素其抑制生物被膜產(chǎn)生能力均有所提高；
　　5.經(jīng)掃描電子顯微鏡觀察，17BIPHE2在1/4×MIC濃度即可促進金黃色葡萄球菌成熟生物被膜消散，1×MIC生物被膜消散同時細菌黏附量有所下降，聯(lián)合萬古霉素促進生物被膜消散同時細菌胞質(zhì)大量外泄。17BIPHE2促進銅綠假單胞菌成熟生物被膜消散效果與上述結果相似，亞抑菌濃度即可促進銅綠假

7、單胞菌生物被膜消散；隨著藥物濃度提高細菌黏附量急劇下降，并且呈現(xiàn)劑量依賴關系。當17BIPHE2濃度達到1×MIC時細菌完整形態(tài)幾乎消失，生物被膜消散同時細胞質(zhì)外泄；抗菌肽聯(lián)合環(huán)丙沙星清除生物被膜作用尤為顯著；
　　6.采用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察單獨17BIPHE2處理銅綠假單胞菌生物被膜后發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度的提高，細菌黏附量逐漸下降，死菌數(shù)逐漸增多，并且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關系。當抗菌肽濃度提升至1×MIC，活菌數(shù)和死菌數(shù)均明顯

8、下降。17BIPHE2聯(lián)合抗生素處理組較單獨使用抗生素處理組細菌黏附量顯著下降，殺菌作用明顯提高；
　　7.Real-Time PCR結果表明，隨著17BIPHE2濃度提高，金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌生物被膜相關基因在轉錄水平表達量均出現(xiàn)不同程度的抑制，且高濃度處理組抑制作用更為明顯。
　　結論：
　　抗菌肽17BIPHE2具有良好的抑制金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌生物被膜黏附、聚集作用，并可促進成熟生物被膜消散。1