體外循環(huán)對(duì)大鼠腸屏障功能損傷機(jī)制探討及生態(tài)制劑的干預(yù)作用.pdf

1、鑒于CPB應(yīng)激反應(yīng)的特殊性以及SDD和微生態(tài)制劑的上述作用，本研究除從細(xì)胞、分子和基因水平上探討CPB對(duì)腸屏障功能損傷的機(jī)制外，還將進(jìn)一步探討生態(tài)療法用于CPB后腸屏障保護(hù)的可行性。旨在為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，亦為臨床減少CPB手術(shù)后胃腸道并發(fā)癥提供有效的防治措施。 實(shí)驗(yàn)材料與方法： 一、實(shí)驗(yàn)材料 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雄性SD大鼠，體重350～450g。 2、主要試劑及藥品：二胺氧化酶(DA0)、D-乳酸

2、標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司，美國(guó))，TNF-α、IL-6、IL-10免疫組化試劑盒(天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司)，水合氯醛(上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站分裝廠)；抗occludin、ZO-1抗體(zymed公司，美國(guó))，)金雙岐(麗珠醫(yī)藥集團(tuán))，sIgA雙抗夾心放免法試劑盒(邦定公司提供)，妥布霉素(常州蘭陵制藥有限公司)，20％乳果糖(云南通用善美制藥有限責(zé)任公司)，大蒜素(廈門(mén)魚(yú)肝油廠)。 3、主要儀器：高速離心機(jī)(TDL-SA)；

3、三用電熱恒溫水浴箱(DH)’-600)；多功能振蕩器；倒置顯微鏡(OLYMPUS-Ix70 Model，Japan)；RX-2000型全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)Technicon公司)；TKR-200C小動(dòng)物呼吸機(jī)(江蘇特力麻醉呼吸設(shè)備公司)；特制微型膜肺(廣東科威醫(yī)療器械有限公司提供采)；小型蠕動(dòng)泵(保定蘭格恒流泵有限公司，BT002300M型)。 二、實(shí)驗(yàn)方法 1、大鼠CPB的建立 取雄性SD大鼠，以10％水合氯

4、醛350 mg·kg-1腹腔內(nèi)注射麻醉，氣管插管接小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸。通過(guò)微型化CPB環(huán)路設(shè)備，經(jīng)右頸靜脈腔房引流、左頸動(dòng)脈灌注方法建立大鼠CPB模型。 2、實(shí)驗(yàn)分組 SD大鼠48只隨機(jī)分為SH、CPB、Y和SDD四組，CPB組24只，其余每組8只。 SH組：為假手術(shù)對(duì)照組(Sham-operated group，SH)，大鼠只在相應(yīng)部位插管，但不進(jìn)行CPB轉(zhuǎn)流。 CPB組：分設(shè)CPB60min結(jié)束時(shí)和

5、停CPB后2、4h時(shí)三個(gè)相點(diǎn)。 Y組：為益生菌組，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前7天，每日用金雙岐(由雙歧桿菌、乳酸桿菌和嗜熱鏈球菌組成的三聯(lián)活菌制劑，含活菌數(shù)1億/g)懸液2ml灌胃。SDD組：為選擇性消化道去污組，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前3天，每日用三聯(lián)抗生素懸液2ml(妥布霉素100 mg+20％乳果糖5ml/kg+大蒜素10mg/kg)灌胃。 3、觀察指標(biāo)和檢測(cè)方法 (1)圍CPB期血液動(dòng)力學(xué)變化； (2)血漿DAO活性、D-

6、乳酸、LPS濃度的變化(化學(xué)法)； (3)血漿IL-6、IL-10、TNF-α和sIgA的變化(放免法)； (4)遠(yuǎn)隔臟器的細(xì)菌易位，腸上皮組織病理檢查(光鏡)；腸粘膜超微結(jié)構(gòu)的檢查(電鏡)； (5)腸粘膜Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)(免疫組織化學(xué)法和Western blot法)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 一、各組大鼠腸屏障功能的變化 1、血漿DAO活性和D-乳酸濃度變化 CPB組各時(shí)相

7、點(diǎn)血漿DAO活性和D-乳酸濃度均明顯升高，與SH組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且以CPB后2h時(shí)最高(P<0.05)。而SH組的DAO活性和D-乳酸濃度無(wú)明顯變化(P>0.05)。Y組和SDD組血漿中DAO活性和D-乳酸濃度與CPB組相比明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與SH組相比仍有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 2、血漿LPS濃度變化和遠(yuǎn)隔臟器的細(xì)菌易位 CPB組靜脈血漿LPS濃度和

8、遠(yuǎn)隔臟器的細(xì)菌易位率逐漸升高，且在停CPB后4h達(dá)高峰，而SH組無(wú)明顯變化，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Y組和SDD組血漿中LPS乳酸濃度和遠(yuǎn)隔臟器的細(xì)菌易位率，與CPB組相比明顯減少(但仍高于SH組)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 二、各組大鼠血漿和小腸組織sIgA濃度的變化 CPB組和SDD組血漿和小腸組織sIgA濃度明顯降低，與SH組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Y組血漿和小腸組織sIgA濃

9、度均升高，與CPB和SDD組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但仍低于SH組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 三、血漿TNF-α、IL-6和IL-10水平變化Y組、SDD組和CPB組血漿TNF-α、IL-6濃度明顯升高，IL-10濃度明顯降低，與SH組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)：Y組和SDD組血漿TNF-α和IL-6濃度明顯下降，IL-10濃度明顯升高，與CPB組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

10、CPB組中血漿TNF-α、IL-6水平在CPB60min達(dá)高峰(P<0.05)，之后略有下降，停CPB后4h時(shí)再次升高；血漿IL-10水平在CPB60min最低，之后略有回升，停CPB后4h再次降低(P<0.05)。 四、各組大鼠腸粘膜形態(tài)學(xué)改變 1、HE染色光鏡觀察 SH組大鼠除腸粘膜下層可見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)外，未見(jiàn)明顯形態(tài)學(xué)改變。CPB組大鼠腸粘膜層變薄，部分絨毛萎縮，絨毛頂部上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落，固有層

11、出血、水腫，中央乳糜管擴(kuò)大，淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，停CPB后2h時(shí)點(diǎn)改變最顯著。Y組和SDD組小腸粘膜及粘膜下層毛細(xì)血管充血減輕，未發(fā)現(xiàn)明顯的粘膜上皮脫落。 2、透射電鏡觀察 SH組大鼠腸上皮細(xì)胞微絨毛排列整齊，細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞器基本正常。CPB組小腸上皮微絨毛脫失，線(xiàn)粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡變性，緊密連接不清，且在停CPB后2h時(shí)點(diǎn)改變最為顯著。Y組和SDD組小腸上皮有輕微微絨毛脫失，線(xiàn)粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡變性，但緊密連接較

12、明顯。 五、各組大鼠腸上皮中occludin和ZO-1蛋白表達(dá)的變化 1、免疫組化結(jié)果 SH組中可見(jiàn)occludin和ZO-1蛋白均勻一致地分布于小腸上皮頂端細(xì)胞的邊緣，呈蜂窩狀或線(xiàn)狀。而CPB組的occludin和ZO-1蛋白分布不均，染色變淡，以停CPB后2h改變最為顯著。而Y組和SDD組的改變明顯減輕。 2、Western blot結(jié)果 SH組occludin p65和ZO-1p220呈現(xiàn)高

13、密度帶；CPB組兩條帶明顯減弱，活性降低，積分光密度值明顯減少(P<0.05)，以停CPB后2h改變最為顯著。與CPB組比較，Y組和SDD組occludin和Zo-1蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但仍低于SH組(P<0.05)。 六、腸上皮緊密連接蛋白表達(dá)變化與腸屏障功能的關(guān)系 為探討CPB后腸上皮緊密連接蛋白表達(dá)的變化與腸粘膜功能的關(guān)系，將CPB后腸上皮細(xì)胞occludin和ZO-1蛋白的表達(dá)和血漿DAO和活性

14、和D-乳酸濃度進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果顯示，緊密連接蛋白表達(dá)與血漿DAO和活性和D-乳酸濃度呈負(fù)相關(guān)(r2=0.8063,0.7312；r2=0.8228，0.8248，P<0.05)。 七、腸上皮緊密連接蛋白表達(dá)變化與炎癥介質(zhì)的關(guān)系 為探討CPB對(duì)腸上皮緊密連接蛋白表達(dá)的影響機(jī)制，將CPB后腸上皮細(xì)胞occludin和ZO-1蛋白的表達(dá)及血漿DAO活性、D-乳酸濃度和血漿TNF-α和IL-6水平變化進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果顯示，緊

15、密連接蛋白表達(dá)與血漿TNF-α、IL-6水平呈負(fù)相關(guān)(r2=0.678，0.6117；r2=0.5530，0.5309，P<0.05)。血漿DAO活性和D-乳酸濃度和血漿TNF-α、IL-6水平正相關(guān)(r2=0.5565，0.6934；r2=0.7073，0.5549，P<0.05)。 結(jié)論： 1、CPB后腸粘膜上皮緊密連接蛋白表達(dá)的下調(diào)可能是CPB所致腸粘膜屏障功能損傷的機(jī)制之一。 2、益生菌預(yù)處理可抑制CPB