rAAV6介導(dǎo)miR361-PSR下調(diào)心肌細胞PDE9A基因表達的體外研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的：構(gòu)建包含心臟肌鈣蛋白T啟動子（cTnT啟動子）和miR361-PSR(hCGin-miR361-PDE9AshRNA)表達框的重組質(zhì)粒，包裝6型重組腺相關(guān)病毒(rAAV6-cTnT-miR361-PSR)，體外轉(zhuǎn)導(dǎo)原代心肌細胞，應(yīng)用RNA干擾原理，下調(diào)PDE9A基因的表達，觀察原代心肌細胞中PDE9A基因mRNA和蛋白水平的變化。
　　方法：⑴構(gòu)建基于miRNA361骨架靶向下調(diào)PDE9A表達的shRNA片段（miR361-

2、PSR片段），與質(zhì)粒pAAV-cTnT-null進行雙酶切(BamHⅠ、NotⅠ)，將得到酶切片段連接構(gòu)成重組質(zhì)粒pAAV-cTnT-miR361-PSR。⑵將pAAV-cTnT-miR361-PSR重組質(zhì)粒、pAAV6包裝質(zhì)粒及輔助質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染293細胞，獲得rAAV6-cTnT-miR361-PSR病毒。用SDS-PAGE測定病毒純度和Dot Blot法測定病毒滴度。⑶重組病毒rAAV6-cTnT-miR361-PSR轉(zhuǎn)導(dǎo)乳鼠原代心

3、肌細胞，提取mRNA和蛋白質(zhì)，用RT-PCR和Western Blot法測定PDE9A基因的表達水平的變化。
　　結(jié)果：①成功構(gòu)建pAAV-cTnT-miR361-PSR重組質(zhì)粒。②成功包裝rAAV6-cTnT-miR361-PSR重組病毒。③rAAV6-cTnT-miR361-PSR重組病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)原代心肌細胞后PDE9A基因的mRNA和蛋白量均明顯低于對照組。
　　結(jié)論：成功包裝rAAV6-cTnT-miR361-PSR重組

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