PCSK6對類風濕關節(jié)炎和膠原誘導性關節(jié)炎滑膜細胞生物學的作用及分子機制研究.pdf

1、目的:1.探討siRNA沉默PCSK6基因對膠原誘導性關節(jié)炎(CIA)成纖維樣滑膜細胞(FLS)生物學行為的影響。2.探討外源性 PCSK6重組蛋白對類風濕關節(jié)炎(RA)成纖維樣滑膜細胞生物學行為的影響及其分子機制。
　　方法:1.采用牛Ⅱ型膠原誘導大鼠CIA模型，取膝關節(jié)滑膜組織原代培養(yǎng)FLS；采用人工合成的大鼠PCSK6特異siRNA特異性抑制PCSK6在CIA FLS中的表達，以negative siRNA為陰性對照組，瞬時

2、轉染24 h、36 h，采用RT-qPCR法檢測抑制效率，同時檢測PCSK6基因沉默后各相關基因的表達；采用MTT、Transwell、細胞劃痕、流式細胞術、ELISA等方法檢測干擾PCSK6表達后對大鼠CIA FLS增殖、侵襲、遷移、細胞周期和相關炎性因子分泌的影響。2.采用PCSK6重組蛋白誘導RA FLS，采用MTT、Transwell、細胞劃痕、流式細胞術、ELISA等方法檢測PCSK6重組蛋白對RA FLS增殖、侵襲、遷移、細

3、胞周期和凋亡以及相關炎性因子分泌的影響；采用RT-qPCR法檢測PCSK6重組蛋白刺激后各相關基因的表達；采用Western blot法檢測PCSK6重組蛋白對基質金屬蛋白酶MMP9以及ERK、STAT3、Wnt3a、Nodal、mTOR、NF-κB p65、NF-κB p105/p50信號轉導通路的影響。采用通路抑制劑PD98059、Stattic、PDTC分別抑制ERK、STAT3、NF-κB p65通路，與PCSK6重組蛋白共同作

4、用于RA FLS，利用MTT、Transwell、細胞劃痕、流式細胞術、ELISA等方法檢測ERK、STAT3、NF-κB p65通路抑制劑對PCSK6重組蛋白誘導的RA FLS增殖、侵襲、遷移、細胞周期和凋亡以及相關炎性因子分泌的影響。
　　結果:1.轉染特異性siRNA-PCSK6后，干擾組與陰性對照組相比，PCSK6 mRNA水平明顯被抑制(P<0.001)，CIA FLS的增殖受到抑制(P<0.001)，細胞的侵襲和遷移能

5、力下降(P<0.001)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)分泌降低(P<0.001)，G0/G1期的細胞數(shù)目增多(P<0.05)，PCSK6下游基因 CXCL9、MMP2、MMP9、NOSTRIN、HIF-1α、MPZL2、IGF2、PADI4表達均明顯下降(P<0.05)。2. PCSK6重組蛋白誘導RA FLS后，與空白對照組相比，150ng/mL PCSK6重組蛋白促進效果最顯著，能使RA FLS的增殖

6、速率顯著提高(P<0.01)，細胞的遷移和侵襲能力加強(P<0.001)，IL-1α、IL-1β、IL-17、IL-6和TNF-α分泌均升高(P<0.05)，S期和G2/M期的細胞數(shù)增多(P<0.01)，細胞晚期凋亡率減少(P<0.01)，PCSK6下游基因C10ORF116、CXCL9、CXCL10、HIF-1α、IL-6、IL-10、IL-26、MMP9、NOSTRIN、TNF-α表達均明顯升高(P<0.001)，MMP9前體和成熟

7、的蛋白量均升高，誘導6h時可顯著激活FLS中的ERK、STAT3、NF-κB p65信號轉導通路。加入通路抑制劑PD98059、Stattic和PDTC后，150ng/mL PCSK6重組蛋白誘導的RA FLS的增殖(P<0.05)、遷移(P<0.001)、侵襲(P<0.001)、炎性因子(IL-1α、IL-1β、IL-17、IL-6和TNF-α)分泌(P<0.05)均受到抑制；通路抑制劑Stattic和PDTC可以逆轉PCSK6重組蛋

8、白對細胞周期的誘導(P<0.05)；通路抑制劑PDTC可以逆轉PCSK6重組蛋白對FLS的細胞凋亡的影響(P<0.05)。
　　結論:1.內源性PCSK6基因沉默對CIA FLS的生物學行為具有一定抑制作用，為進一步研究CIA發(fā)病機制奠定基礎。2.外源性PCSK6重組蛋白對RA FLS的增殖、遷移、侵襲和炎癥因子分泌等生物學行為具有一定促進作用；PCSK6通過參與ERK、STAT3、NF-κB p65信號轉導通路來調控RA FLS