高溫影響番茄花粉發(fā)育的細(xì)胞學(xué)研究及花藥差異表達(dá)分析.pdf

1、番茄（Solanum lycopersicumL.）適宜生長(zhǎng)的日溫為20-25℃，夜間為16-20℃。一般番茄品種，低于15℃時(shí)種子發(fā)芽、授粉受精及番茄轉(zhuǎn)紅受到影響;高于30℃時(shí)種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、萌發(fā)指數(shù)均下降，高于34℃時(shí)生殖發(fā)育受到影響，高于40℃時(shí)植株發(fā)生生理紊亂而熱死。高溫對(duì)花粉發(fā)育的影響直接關(guān)系到授粉受精過(guò)程及最終的果實(shí)和種子質(zhì)量與產(chǎn)量。
　　 本研究選用Micro-Tom番茄為研究對(duì)象，主要研究番茄花粉發(fā)育階段遭遇

2、7d的35℃/30℃的高溫后，其小孢子和花藥發(fā)育的細(xì)胞學(xué)變化;借助于番茄基因組芯片研究小孢子在四分體時(shí)期和雙核時(shí)期的高溫脅迫前后的表達(dá)譜差異，篩選在花粉中表達(dá)的熱脅迫響應(yīng)基因進(jìn)行時(shí)空表達(dá)分析。對(duì)耐熱番茄‘BL1175’和熱敏感番茄‘LA2006’進(jìn)行35℃/30℃的高溫脅迫，研究目標(biāo)基因在它們中的時(shí)空表達(dá)特性。本研究旨在闡明熱脅迫對(duì)番茄小孢子發(fā)育的細(xì)胞學(xué)影響，揭示高溫脅迫對(duì)番茄不同發(fā)育階段小孢子的表達(dá)譜影響規(guī)律，篩選在花粉中表達(dá)的熱脅迫

3、響應(yīng)基因并獲悉其時(shí)空表達(dá)特性，探索番茄熱脅迫響應(yīng)和耐熱的分子機(jī)制，為培育耐熱番茄新品種提供理論依據(jù)。
　　 主要研究結(jié)果如下:
　　 1)以番茄品種‘Micro-Tom’為材料，利用形態(tài)觀察、DAPI染色、石蠟切片等方法，將正常情況下番茄小孢子發(fā)生過(guò)程劃分為5個(gè)階段。研究發(fā)現(xiàn)35℃/30℃高溫脅迫處理不僅導(dǎo)致花粉畸形或敗育、花粉數(shù)量減少、活力低萌發(fā)力差，而且還導(dǎo)致花藥絨氈層、藥隔組織、藥室內(nèi)壁、花藥表皮、環(huán)狀細(xì)胞簇等花藥

4、細(xì)胞結(jié)構(gòu)的發(fā)育異常，并確定番茄花粉發(fā)育過(guò)程對(duì)高溫最敏感的時(shí)期是四分體小孢子時(shí)期和雙核花粉粒時(shí)期。
　　 2)通過(guò)利用基因芯片對(duì)生長(zhǎng)于正常溫度(25℃/20℃)與熱脅迫溫度(35℃/30℃)下的Micro-Tom番茄四分體時(shí)期和雙核期花藥轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜進(jìn)行比較分析，從中獲得了大量高溫脅迫下番茄花藥轉(zhuǎn)錄組信息和花粉發(fā)育相關(guān)基因。對(duì)差異基因的功能分類表明，高溫脅迫對(duì)番茄花粉發(fā)育四分體時(shí)期和雙核期的生物學(xué)過(guò)程影響主要集中在非生物脅迫響應(yīng)、

5、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞構(gòu)建、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝等類別。
　　 3)利用RT-PCR技術(shù)分析了SlMAPKs在小孢子發(fā)育四分體時(shí)期和雙核時(shí)期熱脅迫處理前后在花藥中的表達(dá)特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高溫下，SlMAPK1、SlMAPK3、SlMAPK7、SlMAPK12和SlMAPK16在番茄小孢子發(fā)育過(guò)程中均上調(diào)表達(dá)，但最高峰出現(xiàn)時(shí)材料所受高溫處理時(shí)間的長(zhǎng)短不同。
　　 4)從芯片中篩選出16個(gè)高溫下與番茄小孢子發(fā)育相關(guān)的

6、重要基因，qRT-PCR法進(jìn)行時(shí)空表達(dá)分析顯示，LeARG2、TFHS1和WRKY4在小孢子發(fā)育的四分體時(shí)期顯著上調(diào)表達(dá);HSP70、TAGL12、SlMAPK3、SlMAPK7、MAP3 Ka在雙核時(shí)期顯著上調(diào)表達(dá);GPAT、TMP和Frkl在四分體時(shí)期顯著下調(diào)表達(dá);EXPA5在雙核時(shí)期顯著下調(diào)表達(dá);Rnale在四分體時(shí)期顯著上調(diào)表達(dá)，而在雙核時(shí)期顯著下調(diào)表達(dá);Cel5在四分體時(shí)期顯著下調(diào)表達(dá)，而在雙核時(shí)期顯著上調(diào)表達(dá);LOC5438

7、24(alternative oxidase1a)在這兩個(gè)時(shí)期均上調(diào)表達(dá);MAPK12在四分體時(shí)期表達(dá)量略下降，而在雙核時(shí)期表達(dá)量略上升，但都不顯著。
　　 5)高溫下，耐熱番茄‘BL1175’比熱敏感番茄‘LA2006’具有更強(qiáng)的細(xì)胞膜熱穩(wěn)定性、更高的SOD活性、花粉活力和萌發(fā)率。對(duì)處于開花期的耐熱番茄‘BL1175’和熱敏感番茄‘LA2006’進(jìn)行35℃/30℃熱處理，以小孢子發(fā)育的四分體時(shí)期花藥為材料，對(duì)LeARG2，F(xiàn)R