嗜酸乳桿菌S層蛋白抗病毒感染特性研究.pdf

1、目前益生菌抗病毒作用的存在已被廣大學(xué)者所了解，其菌群中特別是嗜酸乳桿菌具有較明顯的抗致病微生物性質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)研究嗜酸乳桿菌S層蛋白在抗病毒作用中參與的程度以及作用原理，建立適合研究益生菌的原代腸上皮細(xì)胞為平臺(tái)對(duì)嗜酸乳桿菌抗病毒的效果和S層蛋白在抗病毒作用中參與的程度做相關(guān)研究，以期為益生菌的后續(xù)研究提供一定的理論依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)首先對(duì)嗜酸乳桿菌的S層蛋白進(jìn)行基因和蛋白提取鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示菌體存在S層蛋白基因大小為1200bp，

2、使用中性LiC1提取菌體S層蛋白后利用SDS-PAGE分析所提蛋白大小為45ku且蛋白純度較高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。蛋白純化后制備抗S層蛋白兔多克隆血清抗體，經(jīng)Elisa方法檢測(cè)血清抗體效價(jià)為1.0×105，能夠滿足實(shí)驗(yàn)后續(xù)要求。對(duì)于雞腸上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)，選用20日齡即將出殼的SPF雞胚，使用刮取法獲得腸絨毛和隱窩單位，使用膠原蛋白酶Ⅰ和Ⅳ聯(lián)合消化后放入預(yù)先鋪有膠原蛋白的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板里，按照一定的細(xì)胞接種密度，兩個(gè)雞胚可以鋪滿一塊96

3、孔細(xì)胞板，使用與成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)的方法進(jìn)行IEC培養(yǎng)。
　　 為了評(píng)價(jià)S層蛋白在嗜酸乳桿菌抗病毒作用中參與抗病毒的程度，設(shè)置以下實(shí)驗(yàn)組:組1將菌體不同成分先接觸IEC，共同孵育1h使其充分作用，使用緩沖液洗去其他成分后加入病毒孵育1h，再洗去病毒成分，加入細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，直至病毒對(duì)照組出現(xiàn)細(xì)胞病交(CPE)為止，停止細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)行MTT檢測(cè)細(xì)胞活力;組2先加入病毒，后加入菌體各個(gè)成分，具體步驟同上;組3將菌體成分與病毒

4、先孵育1h后一同加入細(xì)胞中三者共同孵育1h，之后洗去成分加入細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)，直至病毒對(duì)照組出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)為止，停止細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)行MTT檢測(cè)細(xì)胞活力。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，S層蛋白對(duì)病毒抑制性最強(qiáng)，菌體其次，脫S層蛋白菌體次之，代謝產(chǎn)物抑制病毒率最低。S層蛋白之所以高于嗜酸乳桿菌的病毒抑制率，因在IEC可承受范圍內(nèi)其蛋白濃度大于嗜酸乳桿菌中菌體表面的S蛋白含量，故在抑制率的數(shù)值上比菌體作用明顯;脫S層蛋白菌體和全菌體相

5、比，前者抑制率低于后者，可見(jiàn)，在菌體抑制病毒作用中S層蛋白起了明顯作用;從代謝產(chǎn)物的病毒抑制率來(lái)看，菌體的次級(jí)代謝產(chǎn)物仍有一定的抗病毒性質(zhì)。通過(guò)與其他成分的比較可見(jiàn)，菌體對(duì)病毒的抑制作用是多方面共同發(fā)揮的結(jié)果，S層蛋白在嗜酸乳桿菌抗病毒作用中發(fā)揮了不可忽視的作用。
　　 4種菌體成分的組1和組3實(shí)驗(yàn)中兩種病毒抑制率都高于組2實(shí)驗(yàn)，說(shuō)明當(dāng)病毒感染細(xì)胞，益生菌成分無(wú)法起到明顯的抑制病毒增殖作用。組1實(shí)驗(yàn)與組3實(shí)驗(yàn)相比，不同成分有所差

6、別。對(duì)于S層蛋白，先加蛋白，后加病毒時(shí)，蛋白才能阻止其感染細(xì)胞，病毒感染細(xì)胞后再加入S蛋白幾乎沒(méi)有明顯效果。這意味著S層蛋白只能在病毒感染前期起到抗病毒感染作用，這說(shuō)明S層蛋白具有預(yù)防病毒感染效果;而當(dāng)病毒感染細(xì)胞后，S層蛋白對(duì)已受病毒侵染的細(xì)胞卻沒(méi)有治療效果，可見(jiàn)，S層蛋白發(fā)揮抗病毒作用的時(shí)期為病毒入侵細(xì)胞之前。菌體最高的病毒抑制率出現(xiàn)在組3和組1組中，菌體的組2病毒抑制率明顯高于S蛋白組、脫S菌體組和代謝產(chǎn)物組，說(shuō)明菌體的綜合抗病毒

7、能力強(qiáng)于各自成分，并對(duì)以感染病毒的IEC有一定的保護(hù)作用。
　　 為了進(jìn)一步研究S層蛋白與病毒之間的作用關(guān)系進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)1借鑒間接ELISA方法檢測(cè)病毒與S層蛋白的粘附性，選擇牛血清白蛋白作為陰性對(duì)照;實(shí)驗(yàn)2評(píng)價(jià)牛血清白蛋白有無(wú)病毒抑制性，方法同S層蛋白的病毒抑制實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，S層蛋白與白蛋白都能粘附IBV和NDV，但是只有S蛋白對(duì)病毒具有顯著的抑制性，白蛋白沒(méi)有明顯的抑制性，說(shuō)明S層蛋白對(duì)病毒的粘附確實(shí)影響并阻礙了

8、病毒對(duì)腸上皮細(xì)胞的感染，具有抑制IBV和NDV感染IEC的能力。
　　 綜上所述，菌體對(duì)病毒的抑制作用是多方面共同發(fā)揮的結(jié)果，S層蛋白在嗜酸乳桿菌抗病毒作用中發(fā)揮了明顯作用。進(jìn)一步研究S層蛋白與病毒之間的作用關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明S蛋白對(duì)病毒的粘附作用起到了抑制病毒感染的效果，產(chǎn)生的S蛋白-病毒復(fù)合體阻礙了病毒對(duì)IEC的感染。目前對(duì)于S層蛋白的研究還有大量的工作要做，本研究?jī)H對(duì)益生菌中嗜酸乳桿菌S層蛋白在雞原代腸上皮細(xì)胞中進(jìn)行的抗病毒