春石斛品種(系)親緣關(guān)系的AFLP分析與轉(zhuǎn)基因研究.pdf

1、石斛屬（Dendrobium）是蘭科（Orchidaceae）中最大的屬，全球約1500余個(gè)野生原種，廣泛分布于世界熱帶、亞熱帶地區(qū)，其中原產(chǎn)我國(guó)的有70余種，目前在藥用和鮮切花、盆花栽培中廣泛應(yīng)用。春石斛(Spring Dendrobium)在園藝上是指石斛蘭中花著生于葉腋，主要自然花期在春季的石斛種或者品種，是目前世界蘭花市場(chǎng)最重要的熱帶蘭盆栽花卉之一。為了創(chuàng)制更多有觀賞價(jià)值的春石斛新品種，在生產(chǎn)和研究上都急需完善相關(guān)的育種技術(shù)體系

2、。但是采用分子標(biāo)記技術(shù)分析春石斛品種間親緣關(guān)系，和建立穩(wěn)定高效轉(zhuǎn)化體系并通過(guò)轉(zhuǎn)化得到符合目的性狀新品種的研究目前均較少。
　　 本研究根據(jù)春石斛主要栽培品種的特點(diǎn)，首先采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，研究了30個(gè)主要栽培品種（系）的親緣關(guān)系，并以其中的一個(gè)重要栽培品種(‘Sanya’)作為受體材料構(gòu)建了其類原球莖的再生體系，采用超聲波輔助農(nóng)桿菌誘導(dǎo)法（SAAT）進(jìn)行CHS和ASACC基因的遺傳轉(zhuǎn)化。主要研究結(jié)果如下:
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3、.采用改良的CTAB法，在進(jìn)行細(xì)胞核裂解之前先加入核分離緩沖液，成功提取出高品質(zhì)的春石斛基因組DNA，OD260nm/OD280nm的比率為1.73-1.85。與試劑盒法和普通CTAB法相比，該方法提取的基因組DNA不僅基本排除了春石斛體內(nèi)多糖及其它次生代謝物質(zhì)對(duì)基因組DNA質(zhì)量的干擾，得率也較高，完全能滿足AFLP等分子生物學(xué)試驗(yàn)對(duì)DNA質(zhì)量的要求。
　　 2.利用熒光AFLP技術(shù)分析了30個(gè)春石斛栽培品種（系）的親緣關(guān)系。選

4、擇EcoRⅠ/MseⅠ酶切組合，8對(duì)引物組合的選擇性擴(kuò)增共得到1102個(gè)條帶，其中多態(tài)性帶占70.6％。利用NTSYS pc Version2.0e軟件對(duì)擴(kuò)增數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用主坐標(biāo)分析法(PCOA)和算術(shù)平均數(shù)的加權(quán)配對(duì)歸類法(UPGMA)等方法對(duì)擴(kuò)增數(shù)據(jù)進(jìn)行品種間的親緣分析，30個(gè)品種或品系材料可分為5個(gè)類群，類群Ⅰ包含6個(gè)品種（系），相似系數(shù)在0.70-0.80之間;類群Ⅱ包含3個(gè)品種（系），相似系數(shù)在0.71-0.76之間;類群Ⅲ

5、包含的品種（系）最多，共13個(gè)，其相似系數(shù)在0.69-0.84之間;類群Ⅳ包含了7個(gè)品種，相似系數(shù)在0.68-0.83之間;而類群Ⅴ僅包含了‘Santana Canary’一個(gè)品種。
　　 3.建立了春石斛品種‘Sanya’和‘China Doll’類原球莖(PLBs)的再生體系。首先通過(guò)盆栽植株的莖尖或腋芽外植體誘導(dǎo)得到無(wú)菌苗;再以無(wú)菌苗莖基無(wú)葉芽莖段為材料，經(jīng)40 KHz超聲波預(yù)處理10 min，接于1/2 MS+6-BA0

6、.2 mg/L固體培養(yǎng)基上，兩個(gè)品種分別得到最高10.5％和9％的PLBs誘導(dǎo)率。系列篩選試驗(yàn)表明，采用液體MS+6-BA0.2 mg/L兩品種的PLBs增殖率均最高，分別為4.57倍/月和4.31倍/月;采用1/2 MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.2mg/L固體培養(yǎng)基，芽增殖率最高分別為2.90和2.66，這兩個(gè)春石斛品種的PLBs誘導(dǎo)率與其它品種間存在顯著性差異。
　　 4.采用超聲波輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)法(SAAT)成

7、功地將CHS和ASACC基因?qū)氪菏贩N‘Sanya’的類原球莖中，獲得轉(zhuǎn)基因株系。采用農(nóng)桿菌共侵染60 min結(jié)合超聲波40 KHz輔助誘導(dǎo)處理10min，在預(yù)培養(yǎng)、共侵染和共培養(yǎng)中均添加100μM AS的處理組合，可使‘Sanya'獲得最高的轉(zhuǎn)化率。通過(guò)Km200 mg/L的篩選，兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)化分別得到63和64個(gè)抗性株系，通過(guò)GUS、PCR和Southern bolt檢測(cè)，獲得20個(gè)轉(zhuǎn)CHS基因株系和10個(gè)轉(zhuǎn)ASACC基因株系，