聯(lián)合新型靶標(biāo)鑒定技術(shù)及多組學(xué)分析的中藥活性成分藥效機(jī)制研究.pdf

1、中藥是中華民族的瑰寶，其中的天然活性成分及代謝產(chǎn)物是新藥創(chuàng)制的重要來源。然而，天然活性成分結(jié)構(gòu)中通常含有多個活性中心，往往作用于多個靶點(diǎn)，通過許多物理或功能上緊密相聯(lián)的分子或通路網(wǎng)絡(luò)而不是某個孤立蛋白發(fā)揮作用，具有多活性中心、多靶點(diǎn)協(xié)同作用發(fā)揮藥效的特點(diǎn)，不適于單靶點(diǎn)藥物藥效機(jī)制研究模式。因此，中藥活性成分多靶點(diǎn)協(xié)同作用的藥效機(jī)制研究已成為中藥現(xiàn)代化道路上的一個重大“瓶頸”。本研究采用新型靶標(biāo)鑒定技術(shù)聯(lián)合多組學(xué)分析策略:第一:篩選出大鼠

2、灌胃黃芩水提液后含藥血清中的體內(nèi)抗肝癌活性成分——千層紙素A，探究其抗腫瘤作用靶點(diǎn)及藥效機(jī)制;第二:鑒定中藥一類新藥丹參素鈉注射劑活性成分丹參素鈉的結(jié)合靶標(biāo)蛋白，探究其心血管保護(hù)藥效機(jī)制。
　　1.全二維HepG2細(xì)胞膜色譜篩選大鼠灌胃黃芩水提液后含藥血清中的體內(nèi)抗肝癌活性成分
　　細(xì)胞膜色譜(CMC)是一種表征藥物與膜受體間相互作用的生物親和色譜技術(shù)，廣泛用于中藥等復(fù)雜體系中活性成分的篩選。在本研究中，建立了一種在線全二維

3、HepG2細(xì)胞膜色譜/富集柱/高效液相色譜/飛行時間質(zhì)譜模型，快速篩選大鼠灌胃黃芩水提液后含藥血清中的活性成分，并利用MATLAB軟件編寫的一個程序，有效地消除了血清中基質(zhì)效應(yīng)的干擾。從黃芩水提液中篩選到黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素A、黃芩新素及半枝蓮種素6種活性成分，同時從黃芩水提液和含藥血清中篩選到漢黃芩素、千層紙素A及黃芩新素3種活性成分。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明從體內(nèi)含藥血清中篩選到漢黃芩素及千層紙素A能夠顯著抑制HepG2細(xì)胞的

4、增殖且呈現(xiàn)濃度依賴性，其IC50值分別為69.83及16.66μM，并且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的調(diào)亡，可作為抗肝癌前體藥物。本研究首次鑒定出黃芩大鼠含藥血清中的體內(nèi)抗肝癌活性成分漢黃芩素、千層紙素A及黃芩新素，所建立的HepG2細(xì)胞膜色譜模型及基質(zhì)干擾消除策略在體內(nèi)活性成分篩選中具有獨(dú)特的優(yōu)勢，同樣適用于其他生物樣品、生物色譜模型及中藥體內(nèi)活性成分研究。
　　2.千層紙素A以轉(zhuǎn)酮醇酶為靶點(diǎn)通過抑制非氧化磷酸戊糖途徑和激活p53通路發(fā)揮抗肝癌

5、作用
　　在前一章研究基礎(chǔ)上，針對抗腫瘤活性最強(qiáng)的活性成分千層紙素A，進(jìn)一步全面探究其體內(nèi)外抗肝癌活性、作用靶點(diǎn)及潛在藥效機(jī)制。細(xì)胞增殖、凋亡和周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，千層紙素A可顯著抑制HepG2細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡并且使細(xì)胞分裂阻滯在G2/M期;裸鼠異種移植模型表明千層紙素A能夠抑制體內(nèi)腫瘤生長。通過藥物親和反應(yīng)靶標(biāo)穩(wěn)定分析(DARTS)，發(fā)現(xiàn)千層紙素A特異性結(jié)合非氧化磷酸戊糖途徑關(guān)鍵酶(Nonoxidative PPP)——轉(zhuǎn)酮醇酶

6、(TKT)，KD值為11.2μM，其相互作用通過分子對接、酶活性測定、蛋白表達(dá)及TKT干擾后抗腫瘤效應(yīng)變化進(jìn)一步證實(shí)。此外，靶向代謝物相對定量分析表明千層紙素A抑制TKT催化活性導(dǎo)致核糖-5-磷酸(R5P，腫瘤細(xì)胞中核糖核苷酸合成的關(guān)鍵原料)產(chǎn)量下降，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明千層紙素A影響缺氧誘導(dǎo)因子。1(HIF-1)信號通路、鞘糖脂生物合成及氨基酸代謝等與非氧化磷酸戊糖途徑密切相關(guān)的通路，且p53凋亡途徑

7、被顯著激活，與TKT干擾后的HepG2細(xì)胞RT-PCR array分析結(jié)果一致。本研究表明，千層紙素A是一種新型TKT抑制劑，通過抑制非氧化磷酸戊糖途徑和激活p53信號通路發(fā)揮抗肝癌作用。千層紙素A可作為新型TKT或非氧化磷酸戊糖途徑抑制劑研發(fā)的前體藥物。
　　3.丹參素鈉通過線粒體途徑保護(hù)HUVEC細(xì)胞抗叔丁基過氧化氫誘導(dǎo)的氧化損傷
　　丹參素鈉是中藥丹參中主要水溶性活性成分丹參素的羧酸鹽，丹參素鈉注射劑已獲CFDA批準(zhǔn)進(jìn)

8、入臨床Ⅰ期試驗(yàn)，用于冠心病及穩(wěn)定性心絞痛的治療。在本研究中，探討丹參素鈉保護(hù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)抗叔丁基過氧化氫(t-BHP)誘導(dǎo)的氧化損傷藥效機(jī)制。結(jié)果表明，丹參素鈉預(yù)給藥可顯著改善t-BHP氧化損傷誘導(dǎo)的HUVEC生長抑制和凋亡?；诔咝б合嗌V/四極桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-QTOF-MS)的細(xì)胞代謝組學(xué)分析表明，t-BHP氧化損傷主要上調(diào)了色氨酸代謝和苯丙氨酸代謝中的13個代謝產(chǎn)物，與線粒體功能和氧化應(yīng)激密切相關(guān)，5

9、0μM丹參素鈉預(yù)給藥可顯著逆轉(zhuǎn)這些代謝變化。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，丹參素鈉預(yù)處理可改善t-BHP氧化損傷誘導(dǎo)的乳酸脫氫酶(LDH)、細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)和線粒體膜電位(MMP)的升高，并可調(diào)節(jié)JAK2/STAT3和PI3K/Akt/GSK-3β及線粒體抗氧化途徑關(guān)鍵抗氧化酶的表達(dá)。結(jié)果表明，丹參素鈉可能通過線粒體抗氧化通路保護(hù)HUVEC抗t-BHP誘導(dǎo)的氧化損傷。
　　4.基于蛋白質(zhì)組芯片及血清代謝組學(xué)分析的丹參

10、素鈉心梗保護(hù)藥效機(jī)制研究
　　丹參素在臨床上廣泛用于心血管疾病的治療，但是目前其直接結(jié)合靶標(biāo)蛋白仍不清楚，心臟保護(hù)藥效機(jī)制仍需深入研究。本研究擬考察丹參素鈉(SAAS)注射劑對心梗大鼠心肌保護(hù)作用，探究其結(jié)合靶標(biāo)蛋白及潛在藥效機(jī)制。通過左冠狀動脈前降支結(jié)扎術(shù)構(gòu)建大鼠心肌梗死(MI)模型，探究SAAS對心梗大鼠保護(hù)作用。結(jié)果表明，SAAS能顯著提高M(jìn)I大鼠心臟功能，降低血清中乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(C

11、K-MB)和心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cTnⅠ)的含量，減輕心梗損傷。采用蛋白質(zhì)組芯片技術(shù)，發(fā)現(xiàn)370個蛋白與SAAS特異性結(jié)合，這些蛋白顯著富集于代謝通路。通過超高效液相色譜/四極桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-QTOF-MS)系統(tǒng)，對心梗大鼠血清進(jìn)行代謝組學(xué)分析。從大鼠血清中共鑒定到26種潛在生物標(biāo)志物，包括各種甘油磷脂(GPLs)和一系列脂肪酸。代謝通路富集分析發(fā)現(xiàn)，心梗大鼠磷脂分解代謝、鞘脂代謝和亞油酸代謝增加，色氨酸代謝減弱，甘油磷脂代謝和原

12、代膽汁酸生物合成受損，而SAAS可顯著逆轉(zhuǎn)這些代謝變化。因此，SAAS可能通過逆轉(zhuǎn)心梗損傷引起的多種代謝變化發(fā)揮心梗保護(hù)作用。本研究不僅有助于揭示SAAS的心血管保護(hù)藥效機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù);此外，由蛋白質(zhì)組芯片鑒定到的與SAAS特異性結(jié)合的370種蛋白可作為其進(jìn)一步發(fā)展的寶貴資源。
　　5.基于大鼠心肌蛋白質(zhì)組學(xué)及轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的丹參素鈉心梗保護(hù)藥效機(jī)制研究
　　前期研究證實(shí)了丹參素鈉對左冠狀動脈前降支結(jié)扎誘導(dǎo)的大

13、鼠心肌梗死(MI)的保護(hù)作用，其潛在機(jī)制與逆轉(zhuǎn)MI損傷引起多種代謝變化有關(guān)。本研究通過對丹參素鈉(SAAS)治療的心肌梗死大鼠心肌組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，進(jìn)一步探究丹參素鈉心血管保護(hù)藥效機(jī)制。結(jié)果表明，在假手術(shù)組、心梗模型組、SAAS治療組之間差異表達(dá)的基因和蛋白質(zhì)是一些重要的轉(zhuǎn)錄因子、輔因子、結(jié)構(gòu)分子和受體，主要參與細(xì)胞過程、生物過程中的細(xì)胞結(jié)合、細(xì)胞成分和分子功能等生命過程。功能富集分析表明，SAAS主要參與調(diào)控肌動蛋白細(xì)

14、胞骨架、吞噬、黏著、緊密連接、細(xì)胞凋亡、MAPK通路及Wnt信號通路等。SAAS可能通過轉(zhuǎn)錄、翻譯尤其是代謝調(diào)控等多層次生命活動發(fā)揮心臟保護(hù)作用。本研究不僅為心肌梗死發(fā)病機(jī)制提供了新的視角，而且從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平闡釋了SAAS的心臟保護(hù)藥效機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
　　綜上所述，本研究主要通過藥物親和反應(yīng)靶標(biāo)穩(wěn)定分析、蛋白質(zhì)組芯片等新型靶標(biāo)鑒定技術(shù)聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)等多組學(xué)分析，探究大鼠灌胃黃芩水提液后含藥血

15、清中的體內(nèi)抗肝癌活性成分千層紙素A及心血管保護(hù)中藥一類新藥丹參素鈉的作用靶標(biāo)蛋白及藥效機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，千層紙素A以TKT為靶點(diǎn)，通過抑制非氧化磷酸戊糖途徑和激活p53信號通路干擾DNA合成發(fā)揮抗肝癌作用，千層紙素A可作為新型TKT抑制劑;丹參素鈉通過調(diào)控代謝及線粒體抗氧化通路保護(hù)HUVEC抗t-BHP誘導(dǎo)的氧化損傷，通過改善大鼠心梗損傷誘導(dǎo)的代謝變化及調(diào)控肌動蛋白細(xì)胞骨架、吞噬、黏著、緊密連接、細(xì)胞凋亡、MAPK通路和Wnt信號通路等，