BDNF對海洛因成癮及戒斷大鼠中腦腹側(cè)被蓋區(qū)-伏隔核通路多巴胺系統(tǒng)的影響.pdf

1、毒品成癮嚴重危害人類的健康和社會發(fā)展，其濫用及濫用后引起的成癮對社會造成極大的危害，也是世界面臨的重大難題和研究的熱點。中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)(MLDS)是大腦獎賞系統(tǒng)的重要組成部分，神經(jīng)元主要為多巴胺（DA）能神經(jīng)元。DA參與認知記憶、自然獎賞、藥物獎賞和情緒活動等各種神經(jīng)機制的調(diào)節(jié)，是 MLDS中調(diào)節(jié)藥物產(chǎn)生的獎賞效應(yīng)的最重要的神經(jīng)遞質(zhì)，此外戒斷癥狀的出現(xiàn)也與腦內(nèi)DA和去甲腎上腺素（NE）的水平相關(guān)。DA在體內(nèi)發(fā)揮生理作用需要多巴胺受體

2、(DRD)和多巴胺轉(zhuǎn)運體(DAT)的參與，藥物成癮能引起DRD和DAT水平發(fā)生變化。MLDS中的DA能神經(jīng)元主要有兩條投射通路：中腦邊緣系統(tǒng)通道(mesolimbic pathway)，從中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(ventral tegmental area,VTA)通往伏隔核(nucleus accumbens,NAc)；中腦皮層通道(mesocortical pathway)，從VTA通往前額葉皮質(zhì)(prefrontal cortex,PFC

3、)。其中VTA和NAc在藥物獎賞、藥物成癮和覓藥動機等行為中扮演著關(guān)鍵的角色。神經(jīng)營養(yǎng)因子家族,包括腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，神經(jīng)營養(yǎng)素3（NT-3)和神經(jīng)營養(yǎng)素4（NT-4）。已有研究證明BDNF，NT-3和NT-4在DA能神經(jīng)元有表達，且在藥物成癮過程中神經(jīng)營養(yǎng)因子通過影響DA能神經(jīng)元引起哺乳動物對成癮藥物行為敏化。大量的研究表明神經(jīng)營養(yǎng)因子參與了精神興奮類藥物如可卡因、安非他命等的成癮。
　　然而DA、DRD、DAT和

4、神經(jīng)營養(yǎng)因子在海洛因成癮、戒斷和復(fù)吸過程中的作用還知之甚少。本實驗通過建立大鼠海洛因成癮、納洛酮催促戒斷和自然戒斷三種模型，觀察BDNF、NT-3和NT-4在NAc腦區(qū)的變化；建立納洛酮戒斷、美沙酮脫毒以及海洛因復(fù)吸模型，觀察大鼠VTA、NAc內(nèi)DA神經(jīng)元陽性表達標記物酪氨酸羥化酶(TH)和NE的最終合成酶多巴胺-β-羥化酶（DβH）的變化；用基因芯片技術(shù)觀察海洛因成癮大鼠NAc內(nèi)與DA相關(guān)的84個基因的表達變化，之后用慢病毒轉(zhuǎn)染和注射

5、反式轉(zhuǎn)錄激活因子(TAT)-BDNF融合蛋白過表達BDNF干預(yù)等手段，觀察在高水平BDNF條件下大鼠條件位臵偏愛（CPP）和納洛酮戒斷的效果，以期闡明在海洛因成癮、戒斷、脫毒和復(fù)吸期間，神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NT-3、NT-4的作用，神經(jīng)元表達DA和去甲腎上腺素（NE）的變化及 BDNF與DA系統(tǒng)的關(guān)系。
　　第一部分、神經(jīng)營養(yǎng)因子在海洛因成癮、戒斷大鼠NAc腦區(qū)的表達變化
　　目的：通過建立大鼠海洛因成癮、納洛酮戒斷和自然

6、戒斷三種模型，觀察BDNF、NT-3和NT-4在NAc腦區(qū)的變化，以期闡明神經(jīng)營養(yǎng)因子在海洛因成癮、戒斷中的作用。
　　方法:成年雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠被隨機分為四組:海洛因成癮組,納洛酮戒斷組,自然戒斷組和鹽水對照組。海洛因成癮組，納洛酮戒斷組和自然戒斷組大鼠均注射海洛因藥液9d使其成癮。第10d，納洛酮戒斷組大鼠注射納洛酮催促戒斷，觀察并記錄納洛酮戒斷組和自然戒斷組大鼠的戒斷癥狀和體重變化。海洛因成癮組和

7、鹽水對照組大鼠于第10d處死，納洛酮戒斷組大鼠于第10d注射納洛酮并觀察戒斷30分鐘之后處死，自然戒斷組大鼠在最后一次注射完海洛因之后不予任何處理，自然戒斷7d后處死。各組大鼠取腦組織NAc腦區(qū)，用免疫組織化學(xué)SABC法和圖像分析法觀察BDNF、NT-3和NT-4陽性細胞的表達，用Western blot技術(shù)檢測BDNF、NT-3和NT-4蛋白表達。
　　結(jié)果：
　　（1）納洛酮戒斷組大鼠在納洛酮作用下，出現(xiàn)明顯的跳躍、站立

8、、濕狗樣抖、扭體、齒顫等戒斷癥狀。與納洛酮戒斷組比較，自然戒斷組大鼠站立、濕狗樣抖、扭體等戒斷癥狀較輕，未觀察到跳躍、齒顫等癥狀。與對照組比較，兩組戒斷大鼠均出現(xiàn)明顯體重減輕。
　?。?）免疫組化結(jié)果顯示，與對照組比較，海洛因成癮組大鼠NAc腦區(qū)BDNF和NT-4陽性細胞免疫染色減弱，平均光密度顯著降低；而在納洛酮戒斷組及自然戒斷組，BDNF和NT-4陽性細胞免疫染色增強，平均光密度明顯增強（p＜0.05）。但NT-3陽性細胞的免

9、疫染色及平均光密度值在海洛因成癮組和自然戒斷組大鼠 NAc腦區(qū)有所增加，而在納洛酮戒斷組NT-3表達減少。
　?。?）Western blot結(jié)果顯示，海洛因成癮降低了BDNF和NT-4在NAc腦區(qū)蛋白水平，而NT-3蛋白水平升高；注射納洛酮30min后，BDNF和NT-4蛋白水平升高，NT-3蛋白水平降低；自然戒斷7d后，BDNF，NT-3和 NT-4蛋白水平均升高。
　　結(jié)論：
　?。?）納洛酮戒斷和自然戒斷大鼠均

10、出現(xiàn)明顯的戒斷癥狀，證明已成功使大鼠海洛因成癮。
　　（2）在海洛因成癮引起的 VTA-NAc通路神經(jīng)適應(yīng)性變化中，BDNF起著負性調(diào)節(jié)作用。
　?。?）在海洛因成癮和戒斷過程中，BDNF和NT-4這兩種神經(jīng)營養(yǎng)因子的變化趨勢大致相同。
　?。?）注射納洛酮催促戒斷，BDNF和NT-4升高；自然戒斷7d后，BDNF，NT-3和 NT-4均升高，表明神經(jīng)營養(yǎng)因子能保護海洛因成癮和戒斷對神經(jīng)組織產(chǎn)生的損傷。
　　第二

11、部分、TH和DβH陽性神經(jīng)元在海洛因戒斷、復(fù)吸大鼠VTA、NAc腦區(qū)表達的變化
　　目的：通過建立海洛因戒斷、美沙酮脫毒及海洛因復(fù)吸大鼠模型，模擬海洛因成癮者戒斷、復(fù)吸的過程，觀察在這期間TH、DβH在VTA和NAc表達的一系列變化，探討DA和NE在海洛因戒斷、復(fù)吸過程中的作用及相互關(guān)系。
　　方法:成年雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、鹽水對照組和實驗組，實驗組又分為納洛酮戒斷組、美沙酮脫毒組和海洛因復(fù)吸組。實驗組大鼠均按體

12、重逐日遞增注射海洛因9d使其成癮，納洛酮戒斷組大鼠注射納洛酮催促戒斷，觀察戒斷癥狀后處死；美沙酮脫毒組大鼠用美沙酮脫毒7d后處死；海洛因復(fù)吸組大鼠先用美沙酮脫毒后再次注射海洛因7d使其成癮，之后處死。鹽水對照組注射與實驗組相當(dāng)劑量的生理鹽水，同期處死相同數(shù)量的大鼠；正常對照組不予任何處理，分批取材。各組大鼠取 VTA、NAc腦區(qū)腦組織，用免疫組織化學(xué)SABC法和圖像分析法觀察分析VTA、NAc腦區(qū)神經(jīng)元表達TH和DβH的變化。
　

13、　結(jié)果：
　?。?）與對照組比較，納洛酮戒斷組和海洛因復(fù)吸組大鼠VTA、NAc內(nèi)TH陽性細胞免疫染色加深，平均光密度值顯著升高，美沙酮脫毒組無明顯變化;
　　（2）DβH陽性細胞的免疫染色在戒斷組大鼠VTA、NAc內(nèi)有所加深，平均光密度值升高，但在脫毒組和復(fù)吸組均染色變淺，平均光密度值降低。
　　結(jié)論：
　?。?）納洛酮戒斷大鼠VTA、NAc腦區(qū)內(nèi)DA增加，DA脫羧轉(zhuǎn)變?yōu)镹E的量也增加，從而引起戒斷癥狀出現(xiàn)；

14、r>　?。?）美沙酮脫毒組大鼠DA水平經(jīng)脫毒之后趨于正常，而NE神經(jīng)元功能尚未完全恢復(fù)。
　?。?）海洛因復(fù)吸抑制了DβH的活性，改變了DA和NE的比值平衡，使VTA、NAc內(nèi)DA含量增加，NE含量減少。
　　第三部分、BDNF過表達條件下海洛因成癮、戒斷大鼠NAc腦區(qū)DA、DRD、DAT的表達變化
　　目的：本研究擬建立大鼠海洛因成癮模型，利用PCR基因芯片分析技術(shù)觀察引起藥物成癮作用的重要部位NAc腦區(qū)BDNF、D

15、A、DRD、DAT以及相關(guān)通路的表達變化；運用BDNF慢病毒轉(zhuǎn)染，注射TAT-BDNF融合蛋白等干預(yù)的手段使BDNF過表達，觀察在高水平BDNF條件下大鼠CPP和納洛酮戒斷的行為學(xué)變化，研究NAc神經(jīng)元中DRD1、DRD2、DRD3、DAT和BDNF的改變及相互關(guān)系。
　　方法:成年雄性SD大鼠隨機分為海洛因成癮組、慢病毒轉(zhuǎn)染組、TAT-BDNF融合蛋白組、空白病毒組、假手術(shù)組和對照組。海洛因成癮大鼠逐日遞增注射海洛因成癮，之后處

16、死取NAc腦區(qū)，利用PCR基因芯片技術(shù)檢測海洛因成癮大鼠NAc腦區(qū)中與DA相關(guān)的84個基因的表達變化；運用BDNF慢病毒轉(zhuǎn)染，注射TAT-BDNF融合蛋白等干預(yù)的手段使BDNF過表達，之后建立大鼠海洛因CPP模型、納洛酮戒斷模型，觀察在高水平BDNF條件下大鼠CPP和納洛酮戒斷的行為學(xué)改變；利用Western blot技術(shù)檢測DRD、DAT的蛋白表達水平；利用qPCR技術(shù)檢測DRD、DAT的基因表達變化。
　　結(jié)果：
　　（

17、1）基因芯片結(jié)果表明，海洛因成癮大鼠NAc腦區(qū)與DA相關(guān)的84個基因中有20個基因發(fā)生了表達改變，其中DRD1、DRD2、DRD3和DAT表達升高，TH和BDNF降低。
　?。?）成功構(gòu)建BDNF過表達慢病毒轉(zhuǎn)染和TAT-BDNF融合蛋白。Western blot方法檢測結(jié)果顯示BDNF過表達的兩種模型建立成功。
　?。?）BDNF過表達大鼠在納洛酮戒斷中體重減輕數(shù)值小于空白病毒組和假手術(shù)組大鼠，戒斷癥狀較空白病毒組和假手術(shù)

18、組大鼠降低。
　?。?）CPP行為學(xué)實驗結(jié)果表明，對照組大鼠訓(xùn)練前后在伴藥箱停留時間無明顯差異，空白病毒組與假手術(shù)組大鼠訓(xùn)練后在伴藥箱停留時間明顯長于訓(xùn)練前（p＜0.05），CPP模型建立成功。BDNF慢病毒組與TAT-BDNF組大鼠訓(xùn)練前后在伴藥箱的停留時間無顯著變化。
　?。?）納洛酮戒斷實驗和CPP實驗各組大鼠NAc腦區(qū)經(jīng)Western blot和qPCR方法檢測，DRD3和DAT在BDNF慢病毒組和TAT-BDNF組