SIRT3在二甲雙胍改善髙脂培養(yǎng)肌細胞自噬和氧化應激中的作用.pdf

1、二甲雙胍是目前治療2型糖尿病的一線藥物。其降糖的可能機制為通過抑制肝葡萄糖輸出，改善外周組織對胰島素的敏感性、增加對葡萄糖的攝取和利用而降低血糖。研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍一方面能夠改善氧化應激，另一方面能夠增強自噬作用。但是其具體機制尚不明確。本研究擬通過觀察二甲雙胍在體外細胞水平對高脂誘導的L6成肌細胞自噬及氧化應激的影響，探討其改善氧化應激、增強自噬的機制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。
　　目的：研究SIRT3在二甲雙胍改善髙脂培養(yǎng)肌細胞

2、自噬及氧化應激中的作用及其機制。
　　方法：采用髙脂（含0.4mmol/L棕櫚酸培養(yǎng)基）干預法建立骨骼肌細胞胰島素抵抗模型。復蘇L6成肌細胞，培養(yǎng)并誘導分化為L6肌細胞，隨機分為正常對照（Con）組和棕櫚酸（PA）組，24小時后分別測定培養(yǎng)基中葡萄糖濃度，判斷造模是否成功。造模成功后，實驗分組如下，正常培養(yǎng)基對照組（Con）、高脂對照組（PA）、二甲雙胍培養(yǎng)基組（PA+Met）、棕櫚酸 siRNA陰性對照組（PA+siRNA）、棕

3、櫚酸 SIRT3敲低組（PA+siSIRT3）、二甲雙胍siRNA陰性對照組（PA+Met+siRNA）、二甲雙胍SIRT3敲低組（PA+Met+siSIRT3）。通過RT-PCR及Western Blot方法檢測SIRT3 mRNA及蛋白表達水平，確定轉(zhuǎn)染是否成功。采用RT-PCR檢測細胞內(nèi)自噬標志蛋白微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3Ⅱ）、p62、Beclin1的mRNA表達水平；Western Blot檢測細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、

4、p62、Beclin1、SIRT3的蛋白表達水平。相應試劑盒測定各組肌細胞氧化應激相關指標，即超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）的活性，還原型谷胱甘肽（GSH）、脂質(zhì)過氧化物酶（LPO）的含量；DHE熒光探針檢測各組肌細胞活性氧簇（ROS）的含量。多樣本間比較采用完全隨機設計單因素方差分析，兩樣本間比較采用t檢驗。
　　結果：
　　1.L6成肌細胞分化成功鑒定
　　與未分化組細胞相比，分化組細胞Desmin

5、、Myogenin的mRNA表達含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示L6成肌細胞分化成功；
　　2.L6成肌細胞IR體外模型的建立
　　采用0.4mmol/L棕櫚酸的培養(yǎng)基孵育細胞24小時后，PA組細胞內(nèi)葡萄糖濃度為20.46±1.52mmol/L，較Con組細胞內(nèi)葡萄糖濃度（14.36±1.38mmol/L）升高，差異具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），提示胰島素敏感性下降，IR模型建立成功；
　　3.C

6、CK8法檢測藥物干預對肌細胞增殖的影響
　　與Con組相比，不同濃度PA組分別作用24h后，均能夠升高肌細胞抑制率，降低增殖率，最終選取0.4mmol/L為合適的PA濃度；與PA組相比，0.5、1.0、2.0mmol/L濃度的Met均使肌細胞增殖率增加，然而并沒有恢復至Con組水平，超過2mmol/L的Met濃度反而造成肌細胞增殖率下降，最終選取的合適的Met濃度為2mmol/L；
　　4.肌細胞轉(zhuǎn)染鑒定
　　各組SI

7、RT3的表達：與Con組相比，PA組SIRT3 mRNA和蛋白表達顯著減少（P＜0.05）；與PA組相比，PA+Met組SIRT3 mRNA和蛋白表達均明顯增加（P＜0.05）；與PA+siRNA組相比，PA+siSIRT3組肌細胞SIRT3 mRNA和蛋白表達均顯著降低（P＜0.05）；與PA+Met+siRNA組相比，PA+Met+siSIRT3組肌細胞SIRT3 mRNA和蛋白表達均顯著降低（P＜0.05），表明SIRT3 siR

8、NA轉(zhuǎn)染成功；
　　5.肌細胞自噬水平
　　5.1.自噬相關指標mRNA表達水平的變化
　　與Con組相比， PA組LC3Ⅱ、Beclin1 mRNA表達水平下降， p62 mRNA表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與PA組相比， PA+Met組干預后顯著上調(diào)LC3Ⅱ、Beclin1 mRNA表達，明顯減少p62 mRNA表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與PA+siRNA組相比， PA+siSIR

9、T3組LC3Ⅱ mRNA表達水平進一步降低（P＜0.05），Beclin1 mRNA表達下降、p62 mRNA表達升高，但差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與PA+Met+siRNA組相比，PA+Met+siSIRT3組LC3Ⅱ、Beclin1 mRNA表達水平進一步降低，p62 mRNA表達水平進一步升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；
　　5.2.自噬相關分子的蛋白表達水平變化
　　與Con組相比，PA組LC3

10、Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1/GAPDH均顯著降低， p62/GAPDH顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與PA組相比， PA+Met組干預后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1/GAPDH的比值明顯升高， p62/GAPDH明顯減低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與PA+siRNA組相比，PA+siSIRT3組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白表達水平進一步降低，Beclin1/GAPDH的蛋白表達下降、p62/GAPDH的蛋白

11、表達升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與PA+Met+siRNA組相比，PA+Met+siSIRT3組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1/GAPDH的蛋白表達水平進一步降低，p62/GAPDH的蛋白表達水平進一步升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；
　　6.肌細胞氧化應激
　　6.1.活性氧（ROS）含量
　　用DHE熒光探針孵育各組細胞，熒光顯微鏡下的觀察結果顯示，與Con組相比，PA組細胞內(nèi)紅色熒光

12、的強度明顯增強，表明細胞內(nèi)ROS含量顯著升高；二甲雙胍組細胞內(nèi)熒光強度明顯減弱，提示ROS生成減少。與PA+siRNA組相比，PA+siSIRT3組細胞內(nèi)的紅色熒光進一步明顯增強；與PA+Met+siRNA組相比，PA+Met+siSIRT3組細胞內(nèi)ROS含量也進一步增加；
　　6.2.SOD、CAT活性及GSH、LPO含量測定
　　L6肌細胞經(jīng)棕櫚酸刺激后，抗氧化酶SOD、CAT的活性較Con組均明顯下降（P＜0.05），

13、GSH含量明顯降低（P＜0.05），LPO含量明顯增加（P＜0.05）；PA+Met組LPO含量較PA組明顯減少（P＜0.05）， SOD活性、GSH含量明顯增加（P＜0.05），CAT活性增加（P＞0.05）。PA+siSIRT3組SOD的活性較PA+siRNA組進一步明顯下降（P＜0.05）， LPO含量進一步明顯增加（P＜0.05），CAT活性、GSH含量進一步降低（P＞0.05）；PA+Met+siSIRT3組SOD、CAT的活

14、性較PA+Met+siRNA組進一步明顯下降（P＜0.05），GSH含量進一步降低（P＞0.05），LPO含量進一步增加（P＞0.05）。
　　結論：
　　1.髙脂孵育能夠降低肌細胞葡萄糖攝取率及胰島素敏感性，同時伴有SIRT3表達下降；二甲雙胍干預能夠改善肌細胞的胰島素抵抗程度，同時伴有SIRT3表達升高。
　　2.二甲雙胍能夠提高髙脂培養(yǎng)肌細胞內(nèi)自噬水平，減少ROS生成，恢復SOD、CAT等抗氧化酶的活性，提高GS