AMPK和SIRT-1參與定時高脂飲食對小鼠肝臟生物鐘基因的影響研究.pdf

1、目的：
　　觀察定時高脂飲食對高脂性脂肪肝小鼠肝臟生物鐘基因及其脂質代謝相關基因表達的影響，并探討其可能的機制。
　　方法：
　　選用雄性昆明種小鼠，嚴格控制明/暗條件（8:00-20:00/20:00-次日8:00），以晚上（19:00）定時給予高脂飲食6周復制高脂性脂肪肝小鼠模型，然后分別在不同授時時相（8:00、12:00、16:00、20:00、24:00和4:00）處置實驗動物，用比色法測定肝組織中總膽固醇（

2、total cholesterol，TC）、甘油三酯(triglycerides，TG)、游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)和氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)含量；用光鏡檢查肝組織的形態(tài)學變化；用ELISA法測定肝組織中AMP依賴的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）含量；用Real-time PCR法

3、檢測肝組織中生物鐘基因Clock、Bmal1、Per1-2和Cry1-2，以及過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)α、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活子-1(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1，PGC-1)α、脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，

4、LPL）、二脂酰甘油酰基轉移酶(diacylglycerol acyltransferase，DGAT)2、乙酰輔酶 A羧化酶-1(acetyl-CoA carboxylase-1，ACC-1)α、肉毒堿棕櫚酰轉移酶-1(carnitine palmitoyltransferase-1，CPT-1)和煙酰胺磷酸核糖轉移酶（nicotinamide phosphoribosyl transferase，NAMPT）mRNA表達的情況；用W

5、estern blot法測定肝組織中AMPK、p-AMPK、沉默信息調節(jié)因子-1(silent information regulator oftranscription1，SIRT-1)、Cry2和Per2的蛋白表達情況。
　　結果：
　　在晚上定時給予高脂飲食6周后，可見小鼠肝組織中有大量的脂質空泡形成，測得的肝組織中TC、TG和FFA含量在不同時間點均有不同程度的升高，而且與正常對照組相比，TC含量的變化較平緩，但在光

6、照期間有明顯的幅度增加；TG含量亦以光照期間升高幅度更為明顯，于12:00達到峰值；FFA含量則未見有明顯的節(jié)律改變。Real-time PCR測定結果顯示，脂質代謝相關基因PPARα、PGC-1α、LPL、DGAT2、ACC-1α和CPT-1 mRNA表達在節(jié)律和/或振幅上有明顯改變，而肝臟生物鐘基因Clock、Bmal1、Per1-2和Cry2 mRNA表達的量也有明顯的改變。Western blot測得Per2和Cry2蛋白表達在

7、振幅上也發(fā)生了明顯的變化。
　　進一步的研究發(fā)現(xiàn)，晚上定時給予高脂飲食6周后，小鼠肝組織中平均 AMPK和p-AMPK蛋白表達均降低。與正常對照組相比，高脂飲食組的AMPK峰值延遲了8 h，振幅在12:00和20:00有明顯的統(tǒng)計學差異；而p-AMPK在這兩個時間點，與正常對照組比較，則在12:00明顯降低，在20:00顯著增加。晚上定時高脂飲食也可以使肝組織中NAMPT mRNA、NAD+含量和SIRT-1蛋白表達在節(jié)律和/或振