纈沙坦和氟伐他汀對(duì)糖尿病腎病腎臟保護(hù)機(jī)制的研究.pdf

1、背景:
　　 糖尿病腎病(DN)是糖尿病重要的微血管并發(fā)癥,也是糖尿病死亡和致殘的主要原因之一,其主要病理特征是腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化。DN的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,目前認(rèn)為是由多種因素協(xié)同作用的結(jié)果,包括高血糖導(dǎo)致代謝異常、血流動(dòng)力學(xué)改變、多種細(xì)胞因子作用和遺傳因素等,而細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)在DN的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用,這些細(xì)胞因子在高血糖作用下通過某些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促使腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化的發(fā)

2、生和發(fā)展。對(duì)DN的治療目前仍是以降糖、降壓、調(diào)脂等為主的綜合治療方案。其中,血管緊張素受體1拮抗劑(ARB)和羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑(他汀類藥物)分別在降壓和調(diào)脂方面發(fā)揮重要作用。
　　 纈沙坦是具有高度選擇性的ARB,通過直接作用于血管緊張素受體1降低血壓而起到腎臟保護(hù)作用;氟伐他汀能有效降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇的合成,可通過調(diào)節(jié)血脂防治腎動(dòng)脈硬化保護(hù)腎臟。目前有很多研究表明,這兩類藥物同時(shí)還有抗細(xì)胞增殖、抗

3、炎癥、免疫調(diào)節(jié)等非依賴降壓和調(diào)脂的腎臟保護(hù)作用,但其具體機(jī)制尚未完全明了。
　　 有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是細(xì)胞將信號(hào)從細(xì)胞膜傳遞到核的主要通路,它是細(xì)胞促增殖和傳遞應(yīng)激信號(hào)的關(guān)鍵激酶,參與了細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞周期的多種過程。其中p38MAPK主要被多種細(xì)胞因子和生理應(yīng)激所激活,又稱為MAPK應(yīng)激信號(hào)通路,近年研究發(fā)現(xiàn)p38MAPK是糖尿病多種致病因素的共同信號(hào)通路的交匯點(diǎn),并參與了腎臟纖維化的

4、發(fā)生和發(fā)展。關(guān)于腎纖維化的發(fā)生機(jī)制目前尚不十分清楚,認(rèn)為可能與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)、血管緊張素Ⅱ(ATⅡ)、腎臟固有細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化以及腎小管上皮細(xì)胞凋亡等有關(guān)。其中TGFpl在腎臟中含量最多,它是一種強(qiáng)致纖維化因子,通過合成細(xì)胞外基質(zhì)(ECM),并刺激腎系膜細(xì)胞分泌ECM而促進(jìn)纖維化的形成。研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1與p38MAPK存在明顯的相互作用,一方面,TGFβ1通過增強(qiáng)p38MAPK的活性發(fā)揮其生物作用,另一方面,p38MA

5、PK通過促進(jìn)TGF-β1的生成而影響DN進(jìn)程,二者是導(dǎo)致腎臟纖維化中的重要因素,但TGF-β受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑所知較少。有研究提示p38MAPK可能是TGF-β1系統(tǒng)下游的一個(gè)通路,介導(dǎo)TGF-β1導(dǎo)致腎小球硬化。而目前關(guān)于纈沙坦和氟伐他汀非依賴降壓和調(diào)脂的腎臟保護(hù)機(jī)制研究主要為其他信號(hào)通路或單藥研究,確切機(jī)制尚未闡明,有關(guān)這兩種藥物是否通過影響TGF-β1以及p38MAPK信號(hào)通路起到腎臟保護(hù)的研究不多。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過研究

6、纈沙坦和氟伐他汀對(duì)體外高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞(HBZY-1)作用后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、細(xì)胞增殖能力、氧化應(yīng)激水平以及p38MAPK、TGF-β1表達(dá)的變化,進(jìn)而從臨床角度觀察應(yīng)用纈沙坦對(duì)早期DN患者血清中TGF-β1水平的影響,探討這兩種藥物對(duì)DN的治療是否與p38MAPK通路調(diào)節(jié)相關(guān)及其與TGF-β1的關(guān)系,進(jìn)而闡明其腎臟保護(hù)作用的機(jī)制,同時(shí)評(píng)估兩種藥物單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用對(duì)DN腎臟保護(hù)作用的比較,為臨床防治DN的有效手段提供理論和實(shí)驗(yàn)依

7、據(jù)。
　　 方法:
　　 一、HBZy-1細(xì)胞的培養(yǎng)和分組
　　 HBZY-1細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于37℃,5％CO2的恒溫孵育箱中,培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM,取第3～5代用于實(shí)驗(yàn),選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HBZY-1收集,并分成正常對(duì)照組(N組,5.5mmol/L葡萄糖)、高糖組(H組,30mmol/L葡萄糖)、甘露醇對(duì)照組(M組,5.5mmol/L葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇)、高糖+纈沙坦組(V組,30mm

8、ol/L葡萄糖+終濃度10μmol/L纈沙坦)、高糖+氟伐他汀組(F組,30mmol/L葡萄糖+終濃度10μmol/L氟伐他汀)、高糖+纈沙坦+氟伐他汀組(VF組,30mmol/L葡萄糖+終濃度均為10μmol/L的纈沙坦和氟伐他汀)、高糖+p38MAPK通路阻斷劑SB203580組(B組,30mmol/L葡萄糖+20μmol/L SB203580),共7組。
　　 二、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè)
　　 培養(yǎng)24

9、小時(shí)后倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞學(xué)形態(tài),四甲基偶氮唑藍(lán)法(MTT)法測(cè)定細(xì)胞存活率和細(xì)胞抑制率。生化法分別測(cè)定各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)和丙二醛(MDA)的含量。
　　 三、p38MAPK、TGβ1 mRNA的測(cè)定
　　 培養(yǎng)24小時(shí)后,收集各組細(xì)胞,加入Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法測(cè)定p38MAPK、TGF-β1 mRNA水平表達(dá)情況。<

10、br>　　 四、p38MAPK、TGFβ1蛋白的測(cè)定
　　 培養(yǎng)24小時(shí)后,收集各組細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白。Western blot方法、免疫細(xì)胞化學(xué)法、免疫熒光方法檢測(cè)各組細(xì)胞中p38MAPK、TGFβ1蛋白表達(dá)水平和分布情況。
　　 五、早期糖尿病腎病患者血清TGFβ1水平的檢測(cè)
　　 納選66例Ⅰ期～Ⅲ期DN患者,根據(jù)24h尿微量白蛋白/肌酐(UMA/Cre)將其分為正常白蛋白尿1組(NA1組,UMA/Cr

11、e＜10μg/mg)、正常白蛋白尿2組(NA2組,UMA/Cre10～30μg/mg)、微量白蛋白尿組(MA組,UMA/Cre30～300μg/mg),同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組(NC組),各DN組又分為應(yīng)用和未用纈沙坦組。所有病例清晨空腹抽取肘正中靜脈血5ml,分離血清,采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),用熒光免疫分析儀檢測(cè)每孔在λ=450nm處吸收度計(jì)算血清TGF-β1水平。
　　 結(jié)果:
　　 一、各組HBZY-1細(xì)

12、胞形態(tài)變化
　　 0小時(shí),各組細(xì)胞形態(tài)無差異,24小時(shí),N組的細(xì)胞形態(tài)正常,結(jié)構(gòu)清晰可辨。M組與N組細(xì)胞形態(tài)相似,細(xì)胞數(shù)量均略增多,胞體略肥大。V、F、VF及B組細(xì)胞形態(tài)改變相似,細(xì)胞間隙變大,細(xì)胞結(jié)構(gòu)不甚清晰,細(xì)胞扁平。H組細(xì)胞雜亂無章,扁平程度最明顯。48小時(shí),H組已全部脫離瓶壁懸浮于培養(yǎng)上清中。
　　 二、各組HBZY-1細(xì)胞的增殖效應(yīng)
　　 與N組相比,H組OD值明顯增加,細(xì)胞存活率提高(P均＜0.05)

13、,V、F、VF、B組與H組相比OD值明顯減低,細(xì)胞存活率減少,細(xì)胞抑制率增高(P均＜0.05),以VF組變化最明顯(P＜0.05)。
　　 三、各組HBZY-1細(xì)胞的氧化應(yīng)激指標(biāo)
　　 與N組相比,H組細(xì)胞上清中SOD和NO活性顯著下降,MDA含量明顯升高(P均＜0.05),V、F、VF、B組與H組相比SOD和NO活性升高,MDA含量下降(P均＜0.05),以VF組變化更明顯(P＜0.05)。
　　 四、各組HB

14、ZY-1細(xì)胞p38MAPK和TGFβ1 mRNA的表達(dá)
　　 與N組相比,H組p38MAPK、TGFβ1 mRNA表達(dá)增加(P均＜0.05)V、F、B組與H組相比p38MAPK、TGFβ1 mRNA表達(dá)均減少(P均＜0.05)。
　　 五、各組HBZY-1細(xì)胞p38MAPK和TGFβ1蛋白的表達(dá)
　　 與N組相比,H組p38MAPK、TGFβ1蛋白表達(dá)增加(P均＜0.05),V、F、VF、B組與H組相比TGFβ1

15、蛋白表達(dá)均減少(P均＜0.05),VF組表達(dá)最少(P＜0.05)。
　　 六、早期糖尿病腎病患者血清TGFβ1水平
　　 與NC組相比,NA1組、NA2組、MA組血清TGF-β1水平依次升高,各組間比較差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05),即MA組較NA1組、NA2組明顯升高(P＜0.05);NA2組較NA1組升高(P＜0.05)。
　　 七、纈沙坦對(duì)早期糖尿病腎病患者血清TGFβ1水平的影響
　　 NA

16、1組中用纈沙坦組血清TGF-β1水平較NA1組未用纈沙坦組明顯下降(P＜0.05);但NA2組和MA組未見到纈沙坦對(duì)血清TGF-β1水平的降低作用(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 一、高糖在一定時(shí)段內(nèi)有刺激HBZY-1增殖的效應(yīng)且此效應(yīng)與滲透壓無關(guān),沙坦和氟伐他汀可減弱高糖所導(dǎo)致的細(xì)胞增殖,并通過抗氧化應(yīng)激保護(hù)腎小球系膜細(xì)胞。
　　 二、纈沙坦和氟伐他汀對(duì)糖尿病腎病的腎臟保護(hù)可能是通過p38MAPK通路,部