外源性NGF對CGRP轉(zhuǎn)基因MSCs治療骨質(zhì)疏松大鼠中CGRP表達(dá)的影響.pdf

1、研究目的：
　　1.評價外源性NGF聯(lián)合CGRP轉(zhuǎn)基因骨髓干細(xì)胞移植治療骨質(zhì)疏松大鼠療效;
　　2.探究外源性NGF對轉(zhuǎn)CGRP的基因的干細(xì)胞移植治療中，CGRP mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響。
　　研究方法：
　　1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的體外分離、純化、及培養(yǎng)。
　　選取6只4周齡雌性SD大鼠，獲取雙下肢長骨骨骨髓組織標(biāo)本，進(jìn)行體外分離、純化、傳代培養(yǎng)，獲得適量的骨髓MSCs細(xì)胞。
　　

2、2.構(gòu)建CGRP基因表達(dá)載體。
　　以實(shí)驗(yàn)同源SD大鼠基因組為模板，PCR擴(kuò)增CGRP基因的編碼序列，進(jìn)行pBaBb-puro-CGRP真核表達(dá)載體構(gòu)建。
　　3.轉(zhuǎn)染MSCs及制備穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因CGRP-MSCs細(xì)胞系。
　　將已構(gòu)建pBaBb-puro真核表達(dá)載體，用293FT（人胚腎）細(xì)胞系增殖后，反轉(zhuǎn)錄(Retrovirus)轉(zhuǎn)染至骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，待細(xì)胞增值融合時，病毒進(jìn)行感染，進(jìn)一步篩選，獲得穩(wěn)定CGRP轉(zhuǎn)

3、基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞系(CGRP-BMSCs)，擴(kuò)增、培養(yǎng)。
　　4.建立骨質(zhì)疏松大鼠實(shí)驗(yàn)動物模型。
　　使用維甲酸混懸液連續(xù)灌胃實(shí)驗(yàn)SD大鼠，日劑量70mg/kg/1次，連續(xù)4周（分籠飼養(yǎng)，每籠4只，在相對濕度為50％-80％，室溫22-26°條件下的清潔級環(huán)境中，全部予以標(biāo)準(zhǔn)自由攝食、飲水飼養(yǎng)），獲取骨質(zhì)疏松SD大鼠實(shí)驗(yàn)動物模型。
　　5.實(shí)驗(yàn)動物干預(yù)處理。
　　實(shí)驗(yàn)干預(yù):A組，空白對照組，無菌生理鹽水PBS

4、處理;B組，單純骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療（以對照組同等計量的MSCs移植治療處理）;C組，轉(zhuǎn)基因降鈣素基因相關(guān)肽骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療組（CGRP-MSCs移植治療處理）;D組，外源性神經(jīng)生長因子聯(lián)合轉(zhuǎn)基因降鈣素基因相關(guān)肽骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療組（同等計量的CGRP-MSCs+NGF移植治療處理）。
　　6.實(shí)驗(yàn)標(biāo)本收集、數(shù)據(jù)處理分析。
　　分別在上訴實(shí)驗(yàn)干預(yù)處理后的第1、2、3w后，斷頸法處死實(shí)驗(yàn)動物，三個時相每組隨機(jī)

5、選取5只，獲取股骨組織標(biāo)本，并提取總蛋白，和總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用實(shí)時定量熒光PCR法和Western blot檢測法，檢測3個時間階段中各組大鼠股骨骨組織中CGRP mRNA和蛋白的相對表達(dá)水平，收集數(shù)據(jù)，采用spss19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、處理。
　　研究結(jié)果：
　　1.實(shí)驗(yàn)處理的3個時間相，與A組（空白對照組）比較，C組(CGRP-MSCs移植治療處理組)和D組（CGRP-MSCs+NGF移植治療處理）中

6、CGRP的CGRP mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P＜0.01);
　　2.實(shí)驗(yàn)處理1周后，C（CGRP-MSCs移植處理）和D（CGRP-MSCs+NGF移植處理）組上調(diào)水平差異明顯(P＜0.01)，D組CGRP的CGRP mRNA和蛋白的表達(dá)水平低于C組;在實(shí)驗(yàn)處理2周后，C組和D組之間仍保持顯著差異(P＜0.05)，D組CGRP的CGRP mRNA和蛋白的表達(dá)水平仍低于C組;
　　3.實(shí)驗(yàn)處理3周后，C組和D組CG

7、RP的CGRP mRNA和蛋白的表達(dá)水平上調(diào)水平差異明顯縮小，二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　研究結(jié)論：
　　1.無論是否使用外源性NGF，CGRP轉(zhuǎn)基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療骨質(zhì)疏松大鼠，實(shí)驗(yàn)大鼠在CGRP的CGRP mRNA和蛋白的表達(dá)水平均提高，治療效果肯定。
　　2.外源性使用NGF聯(lián)合CGRP轉(zhuǎn)基因-MSCs移植治療骨質(zhì)疏松大鼠中，至少在CGRP的CGRP mRNA和蛋白表達(dá)層面，未表現(xiàn)出促進(jìn)作