健康人、腹瀉兒童與鼠形動(dòng)物腸道肺炎克雷伯菌的病原學(xué)特征和耐藥性分析.pdf

1、目的：
　　比較和分析不同來源（動(dòng)物、病人與健康人）腸道中肺炎克雷伯菌的血清型、基因型以及耐藥特征，探究在社區(qū)環(huán)境中，鼠形動(dòng)物攜帶的肺炎克雷伯菌與人群分離的耐藥性與高毒力菌株之間的關(guān)系，為更好地預(yù)防和控制多重耐藥和高毒力肺炎克雷伯菌引起的社區(qū)獲得性感染提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　方法：
　　(1)2015年5-9月，在廣東省南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科連續(xù)收集健康人與兒科門診腹瀉兒童的糞便樣本，將收集的糞便樣本置于運(yùn)送培養(yǎng)基

2、于(2～8)℃暫時(shí)保存當(dāng)天運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室，同時(shí)采集健康人和門診腹瀉兒童的基本信息;
　　(2)同時(shí)期，在廣東省白云區(qū)南方醫(yī)院及其附件以及周圍居民區(qū)（約為65萬平方米范圍）按照《中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》(SN/T2788-2011)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)利用籠捕法捕鼠。鼠籠布置地點(diǎn)為建筑物墻邊、下水道、垃圾堆、倉庫、廚房、垃圾桶、水溝等地點(diǎn);以“晚放晨收”形式每月捕鼠一次，連續(xù)捕鼠5個(gè)月;捕獲的鼠形動(dòng)物按要求立即運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，按照《實(shí)

3、驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌學(xué)檢測標(biāo)本采集》(GB/T14926.42-2001)要求解剖并采集鼠形動(dòng)物糞便樣本;
　　(3)所有收集的糞便樣本按照《中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》(SN/T2788-2011)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)分離肺炎克雷伯菌，根據(jù)2014年美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)制定的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)（CLSI標(biāo)準(zhǔn)）采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)對(duì)氨芐西林、哌拉西林、頭孢唑啉、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢替坦、頭孢呋辛、頭孢他啶、阿莫西林-克拉維酸

4、、氨曲南、慶大霉素、阿米卡星、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、復(fù)方新諾明、氯霉素、呋喃妥因、美羅培南共19種抗菌藥物進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，依照2014年CLSI標(biāo)準(zhǔn)篩檢產(chǎn)ESBLs菌株，同時(shí)利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)實(shí)驗(yàn)方法檢測產(chǎn)ESBLs菌株中SHV、TEM和CTX-M三種耐藥基因;
　　(4)對(duì)分離培養(yǎng)的所有肺炎克雷伯菌利用細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒提取核酸，通過PCR實(shí)驗(yàn)方法篩檢高毒力肺炎克雷伯菌莢膜血清型（包括K1、K2、K5、K

5、20、K54和K57六種血清型），同時(shí)對(duì)該六種高毒力血清型菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，通過PCR實(shí)驗(yàn)方法檢測該六種高毒力血清型菌株中magA、wcaG、rmpAuge、 kfu和Aerobactin六種毒力基因;根據(jù)MLST官網(wǎng)的參考文獻(xiàn)的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行MLST分析。
　　(5)全部數(shù)據(jù)整理并且輸入Excel表格，采用SPSS20.0版軟件進(jìn)行匯總分析。采用x2檢驗(yàn)（或Pearson Chi-Square或Fisher's Exact Tes

6、t）進(jìn)行率的比較，以P＜0.05作為有顯著性差異的判定標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果：
　　(1)2015年5-9月期間，共收集健康人糞便樣本275份、腹瀉兒童糞便樣本105份，肺炎克雷伯菌檢出率分別為66.2％(182/275)和65.7％(69/105)。共捕獲鼠形動(dòng)物190只，包括105只鼩鼱、80只褐家鼠、3只小家鼠和2只黃胸鼠，捕獲率為26.8％;鼩鼱捕獲率高于褐家鼠、小家鼠和黃胸鼠(x2=189.834，P＜0.001)，褐家

7、鼠捕獲率顯著高于其他家鼠(x2=147.225，P＜0.001)，然而鼩鼱與褐家鼠的捕獲率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肺炎克雷伯菌在鼠形動(dòng)物糞便樣本檢出率為78.4％(149/190)，小家鼠和黃胸鼠糞便樣本中均未檢出肺炎克雷伯菌。鼠形動(dòng)物腸道中肺炎克雷伯菌攜帶率高于健康人和腹瀉兒童(x2=9.266，P=0.010)。
　　(2)所有肺炎克雷伯菌均對(duì)氨芐西林耐藥。健康人糞便樣本檢出182株肺炎克雷伯菌的抗生素藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果:青霉素類抗生

8、素哌拉西林敏感率為19.2％;第一代頭孢類抗生素頭孢唑林敏感率為2.2％;第三代頭孢類抗生素頭孢噻肟、頭孢他啶敏感率為35.2％和65.4％;第四代頭孢類抗生素頭孢吡肟敏感率為54.4％;喹諾酮類、磺胺類、碳青霉烯類抗生素敏感性較高。腹瀉兒童糞便樣本所檢出69株肺炎克雷伯菌抗生素藥敏試驗(yàn)結(jié)果:哌拉西林敏感率為19.2％;頭孢唑林、頭孢噻肟、頭孢他啶和頭孢吡肟敏感率分別為1.4％、46.4％、82.6％和69.6％;喹諾酮類、磺胺類、碳青

9、霉烯類抗生素敏感性較高。鼠形動(dòng)物糞便樣本所檢出149株肺炎克雷伯菌對(duì)哌拉西林敏感率為10.7％;鼠形動(dòng)物攜帶的肺炎克雷伯菌對(duì)頭孢唑啉耐藥情況嚴(yán)重，敏感率為3.4％;頭孢噻肟和頭孢他啶敏感率分別為36.9％和65.1％;頭孢吡肟敏感率為67.8％;喹諾酮類、磺胺類、碳青霉烯類抗生素敏感性較高。健康人、腹瀉兒童和鼠形動(dòng)物腸道中肺炎克雷伯菌多重耐藥率分別為47.8％、29.0％和40.9％，其中腹瀉兒童多重耐藥率最低(x2=7.382，P=0

10、.025);三者產(chǎn)ESBLs菌株陽性率分別為17.0％、14.5％和10.7％，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=2.661，P=0.264)。對(duì)產(chǎn)ESBLs菌株進(jìn)行耐藥基因檢測，產(chǎn)CTX-M和TEM型酶菌株陽性率分別為38.6％(22/57)和28.1％(16/57)(x2=1.421，P=0.233)，未檢出產(chǎn)SHV型酶菌株。在健康人、腹瀉兒童和鼠形動(dòng)物中，TEM型檢出率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異(x2=5.585，P=0.061)，CTX-M型

11、在腹瀉兒童檢出率最高(x2=9.039，P=0.011)，但是，在健康人與鼠形動(dòng)物樣本中檢出率差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.032，P=0.858)。
　　(3)400株肺炎克雷伯菌經(jīng)PCR檢測得，K1、K2、K5、K20、K54和K57六種高毒力肺炎克雷伯菌血清型檢出率分別為:1.0％、1.0％、1.5％、0.8％、0.5％和1.2％。其中，健康人和腹瀉兒童糞便樣本共檢出16株（檢出率為6.4％），K1、K2、K5、K20、K5

12、4和K57檢出率分別為1.6％、1.6％、0.4％、0.8％、0.8％和1.2％。在鼠形動(dòng)物糞便樣本共檢出8株（檢出率為5.4％），K5、K20、K57檢出率分別為3.4％，0.7％和1.3％，未檢出K1、K2、K54血清型;所有K1和K2分離株對(duì)大部分抗生素敏感，然而K5、K20和K57分離株對(duì)青霉素類和第一代頭孢類抗生素耐藥嚴(yán)重，部份K5和K57分離株對(duì)第三代頭孢類抗生素耐藥。高毒力分離株毒力基因uge、kfu、wcaG、aerob

13、actin、rmpA和magA檢出率分別為95.8％、33.3％、29.2％、29.2％、29.2％和16.7％。magA基因僅存在于K1型分離株，而uge在六種血清型均可檢出。所有K1型分離株與K20、K54和K57部分分離株檢出wcaG基因。除了K2型分離株之外，其他血清型均可檢出kfu基因。在高毒力分離株中，大部分STs為首次出現(xiàn)的基因型，而臨床感染常見的ST23、ST86、ST37和ST65同時(shí)也在健康人和腹瀉兒童樣本中檢出，并

14、且首次在鼠形動(dòng)物標(biāo)本中檢出臨床患者常見的ST268基因型。
　　結(jié)論:
　　(1)健康人與腹瀉兒童腸道中肺炎克雷伯檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異，但是二者的檢出率均低于鼠形動(dòng)物腸道中肺炎克雷伯菌的檢出率。
　　(2)健康人、腹瀉兒童和鼠形動(dòng)物糞便樣本中肺炎克雷伯菌分離株對(duì)青霉素類、頭孢類抗生素耐藥情況嚴(yán)重，特別是對(duì)第一代和第三代頭孢類抗生素，但對(duì)喹諾酮類、磺胺類、碳青霉烯類抗生素敏感率較高。鼠形動(dòng)物與人類共處同一生活環(huán)境，

15、攜帶的肺炎克雷伯菌耐藥譜及耐藥基因型與健康人相似，提示鼠形動(dòng)物可能成為多重耐藥肺炎克雷伯菌的儲(chǔ)存宿主和傳染源。
　　(3)雖然鼠形動(dòng)物與人群樣本的肺炎克雷伯菌高毒力血清型分布不完全一致，但是部分高毒力血清型在鼠形動(dòng)物以及人樣本中均能檢測到。在健康人和腹瀉兒童樣本中檢出K1、K2、K5、K20、K54和K57六種高毒力莢膜血清型，其中以K1、K2和K57檢出率較高;在鼠形動(dòng)物糞便標(biāo)本中，K5、K20和K57檢出率最高，但未檢出K1、

16、K2和K54型。K1和K2型分離株對(duì)大部分抗生素敏感，而K5、K20和K57型分離株對(duì)青霉素類和頭孢類抗生素耐藥率較高。magA是K1型菌株重要的毒力因子并且僅存在于K1型分離株;wcaG存在于K1、K20、K54和K57型分離株，與其強(qiáng)毒力有關(guān);rmpA與aerobactin的平行關(guān)系提示二者可能協(xié)同發(fā)揮毒力作用。
　　(4)鼠形動(dòng)物、健康人和腹瀉兒童腸道中均可以檢出作為社區(qū)獲得性感染重要病原體的高毒力肺炎克雷伯菌常見基因型，提