采用Genome shuffling技術(shù)選育堿性果膠酶高產(chǎn)菌株.pdf

1、微生物果膠酶作為四大酶制劑之一，其應(yīng)用領(lǐng)域非常廣泛。堿性果膠酶不但拓寬了其作用pH的范圍，還拓寬了其應(yīng)用領(lǐng)域，在紡織業(yè)、植物亞麻脫膠、棉的精煉、造紙業(yè)等方面有著顯著價(jià)值。
　　本論文以野生枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ZGL14為出發(fā)菌株，采取多種誘變方式得到多種來(lái)源的正突變菌株，結(jié)合雙親原生質(zhì)體滅活和基因組改組(Genome shuffling)技術(shù)篩選高產(chǎn)的堿性果膠酶菌株，并對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，為堿性果膠

2、酶的研究和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠基基礎(chǔ)研究。
　　通過(guò)傳統(tǒng)誘變ZGL14得到堿性果膠酶高產(chǎn)菌株。采取紫外誘變和三種抗生素（氨芐青霉素鈉、氯霉素和鏈霉素）單因素誘變。紫外的最佳誘變條件為:紫外照射功率為20w，垂直照射距離為30cm，照射時(shí)間為10min;氨芐青霉素鈉的最佳誘變濃度為0.03μg/mL;氯霉素的最佳誘變濃度為3μg/mL;鏈霉素最佳誘變濃度為20μg/mL。通過(guò)透明圈(H/C)法，挑取比值較大的采取復(fù)篩搖瓶發(fā)酵，最后篩選獲得7

3、株酶活性較高的菌株，其中UV12較原始菌株酶活性提高了21.83％。
　　通過(guò)紫外—鏈霉素20復(fù)合誘變和60Co-γ—鏈霉素20復(fù)合誘變，分別篩選得到突變菌株UV-S45和C-S50，其酶活力分別提高了24.7％和25.6％。
　　通過(guò)對(duì)ZGL14原生質(zhì)體的制備、再生以及原生質(zhì)體滅活條件的優(yōu)化，確定了原生質(zhì)體制備的最優(yōu)條件為:二次轉(zhuǎn)接對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期9h的菌株制備原生質(zhì)體最優(yōu)，溶菌酶的濃度0.2 mg/mL，酶解作用時(shí)間10min

4、，酶解作用溫度32℃，滲透壓pH7.0。再生培養(yǎng)基以琥珀酸鈉作為滲透壓穩(wěn)定劑并和Ca2+作用再生效果較好;單層培養(yǎng)方式有利于再生。原生質(zhì)體紫外滅活照射70min，熱滅活70℃水浴熱處理20min。
　　原生質(zhì)體融合采用聚乙二醇(PEG6000)誘導(dǎo)，融合子的選擇采用雙親滅活原生質(zhì)體融合。融合菌株選取UV-S45、C-S50、UV10、UV12、S9和原始菌株ZGL14作為出發(fā)菌株，通過(guò)2輪基因組重排，獲得一株產(chǎn)酶穩(wěn)定的高產(chǎn)重組菌株

5、105，酶活力是原始菌株的1.63倍。
　　對(duì)重組菌株105發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)。主要考察了氮源、碳源、無(wú)機(jī)鹽、金屬離子、接種量、發(fā)酵初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響。經(jīng)過(guò)單因素優(yōu)化和響應(yīng)面結(jié)果分析，確立了最適發(fā)酵條件為:果膠1.9％，蛋白胨1％，K2HPO40.26％，KH2PO40.16％，接種量9％，發(fā)酵初始pH9.0，40℃培養(yǎng)24h，酶活力可達(dá)1030.71U/mL，相對(duì)重組菌株105酶活力提高了115.85％，是原始