多壁碳納米管致大鼠肺損傷研究.pdf

1、碳納米管是現(xiàn)今全球消費量最大的納米材料之一。因其具有強度高、吸收能力強、熱穩(wěn)定性好和電磁學性能優(yōu)異等多種特性,現(xiàn)已應用在生物醫(yī)藥領域,可用于疾病診斷、輔助成像和藥物傳輸。碳納米管根據其結構不同分為:多壁碳納米管(multi-wall carbon nanotubes,MWCNTs)和單壁碳納米管(single-wall carbonnanotubes,SWCNTs)。碳納米管質量輕,可在空氣中傳播,尤其可以在肺部沉積,已有的研究結果提示

2、物質在納米尺度可能比在常規(guī)尺度下表現(xiàn)出更大的毒性。因此,碳納米管的呼吸毒性引起人們廣泛的關注。
　　 目前國內外的研究多集中于SWCNTs的健康效應,對MWCNTs的研究較少。鑒于MWCNTs和SWCNTs理化性質不同,可能導致機體健康效應的差異。因此有必要對MWCNTs的環(huán)境和生物安全性進行研究,為相關衛(wèi)生標準的制定提供科學依據,為人群的健康防護奠定基礎。
　　 本課題以已知成份和粒徑大小的MWCNTs為研究對象,采用

3、體外培養(yǎng)的巨噬細胞和肺泡Ⅱ型上皮細胞研究MWCNTS的細胞毒性和氧化損傷作用,并采用整體動物氣管滴注染毒研究MWCNTS致肺損傷作用,及所致肺損傷的時間效應。
　　 第一部分為體外實驗,研究MWCNTs對巨噬細胞和肺泡Ⅱ型上皮細胞的細胞毒性及氧化損傷作用。本次實驗將小鼠巨噬細胞株(RAW264.7)和人肺泡Ⅱ型上皮細胞暴露于2.5、10、25、100μg/ml的MWCNTs混懸液,染毒24h后,采用MTT法測定細胞存活率、用化學

4、測定法檢測細胞培養(yǎng)上清液中的總蛋白(TP)、乳酸脫氫酶(LDH)和一氧化氮(NO)水平,并測定細胞內谷胱甘肽(GSH)、超氧化物岐化酶(SOD)和丙二醛(MDA)等細胞毒性及氧化損傷指標。用魯米諾誘導的化學發(fā)光法測定細胞內氧自由基水平,并分別測定了染毒后RAW264.7細胞的吞噬能力和A549細胞產生活性氧族的情況。
　　 RAW264.7細胞和A549細胞在染毒24h后細胞形態(tài)發(fā)生改變。隨著染毒濃度的上升,兩種細胞存活率下降,

5、并存在劑量依賴關系。在相同染毒濃度下,RAW264.7細胞的存活率比A549細胞高。細胞培養(yǎng)上清液中TP、LDH和NO的釋放水平隨著染毒濃度的增高而逐漸增加,各染毒組RAW264.7細胞和A549細胞內的GSH、SOD含量呈降低趨勢,MDA含量呈升高趨勢,顯示出劑量依賴關系。在相同染毒濃度下,A549細胞表現(xiàn)出更嚴重的細胞毒性反應和氧化損傷情況。此外,在誘導兩種細胞的氧自由基活性增加的同時,MWCNTs不但能顯著降低巨噬細胞的吞噬功能,

6、其還能誘導A549細胞ROS水平升高,造成RAW264.7細胞和A549細胞抗氧化能力降低,引起氧化損傷,這可能是造成細胞損傷的重要途徑之一。
　　 第二部分為整體動物實驗,研究MWCNTs致肺損傷作用。將12周齡Wistar大鼠192只,雌雄各半,隨機分成6組,即生理鹽水對照組、DNA鈉鹽溶劑對照組、超細碳黑組、MWCNTs染毒組(2.0、10.0、20.0mg/ml)。采用氣管滴注法染毒,每天染毒一次,連續(xù)染毒3d。最后一次

7、染毒結束后24h、7d、28d和90d分四批處死大鼠,收集肺灌洗液,測定灌洗液中總蛋白(TP)、乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(AKP)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物岐化酶(SOD)和丙二醛(MDA)等細胞毒性及氧化損傷指標,并觀察肺組織病理改變。實驗結果表明,灌洗液中TP、LDH、AKP和MDA含量隨著染毒濃度的增加而升高,并隨著時間的延長而降低;灌洗液中GSH、SOD均有不同程度的降低程度,隨著時間的延長有不同程度的升高,呈劑量依

8、賴關系。肺組織病理學檢顯示各染毒組出現(xiàn)單核細胞浸潤和淋巴細胞增生、黏膜損傷和血管出血等炎癥性病變,肺泡腔內和肺泡間隔中可見黑色MWCNTs顆粒沉積,并且隨著劑量的增加病變程度有加重的趨勢。隨著時間的延長,各染毒組的病理改變有所緩解。與超細碳黑組相比,染毒量組在7d時肺出現(xiàn)了肉芽腫,隨著時間的延長于90d時發(fā)展為多中心性肉芽腫,此外,中、高劑量染毒組于90d時肺組織中出現(xiàn)膠原細胞沉積。電鏡下可見MWCNTs染毒組出現(xiàn)細胞核膜腫脹、環(huán)形線粒

9、體、以及內質網擴張等改變。另外,MWCNTs于28d開始出現(xiàn)肺門淋巴結轉移,提示MWCNTs通過呼吸道途徑進入體內后,可經肺淋巴系統(tǒng)轉移到其他組織器官。總之,實驗結果表明MWCNTs可引起肺組織炎癥反應和氧化損傷,對大鼠具有肺毒性作用。
　　 本次研究采用的MWCNTs(Nanocyl(R)3150)由日本名古屋工業(yè)大學提供,其粒徑為10nm,純度＞95％,碳含量＜5％,長度＜1μm。用脫氧核苷酸鈉鹽(DNA鈉鹽)提高MWCNT