附子毒動(dòng)學(xué)及烏頭堿吸收與代謝特征研究.pdf

1、目的和意義:附子為毛茛科植物烏頭(Aconitum carmichaeli Debx)的子根加工品,是中醫(yī)臨床上治療風(fēng)濕性和心血管性疾病的常用中藥,具有較強(qiáng)的抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用。但在臨床上出現(xiàn)了較多的不良反應(yīng)和中毒事件,盡管經(jīng)過炮制已降低了附子的毒性,但仍使其應(yīng)用受到極大限制。文獻(xiàn)報(bào)道,附子的治療劑量與中毒劑量非常接近,這與其所含的烏頭類二萜生物堿具有較強(qiáng)毒性有關(guān),其中以烏頭堿最具有代表性。因此,在研究附子毒代動(dòng)力學(xué)特征時(shí),可選擇烏頭

2、堿作為附子的特征性標(biāo)志物,從烏頭堿的吸收、分布、代謝和排泄(ADME)等方面探求附子的體內(nèi)特征及機(jī)理可為附子的毒性監(jiān)控提供依據(jù)。本論文以烏頭堿為特征性標(biāo)志物,研究了烏頭堿及附子醇提物單次和多次給藥時(shí)烏頭堿的毒動(dòng)學(xué)特征,并闡明了烏頭堿的吸收和代謝機(jī)理,為附子的毒性預(yù)警和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　 方法
　　 一.附子提取物和烏頭堿毒代動(dòng)力學(xué)研究
　　 1.附子代表性毒性成分烏頭生物堿類的安全窗評(píng)價(jià)研究采用小鼠急性毒性

3、實(shí)驗(yàn),觀察口服灌胃烏頭類生物堿(烏頭堿,中烏頭堿及次烏頭堿)后小鼠一般狀況及其死亡率,計(jì)算出其LD50及其95％可信限；采用醋酸扭體鎮(zhèn)痛模型,觀察小鼠在不同濃度劑量組以及陰性、陽性對(duì)照組小鼠的扭體次數(shù),計(jì)算其疼痛抑制率。通過其死亡率和疼痛抑制率得到烏頭類生物堿的量效反應(yīng)雙曲線。
　　 2.附子代表性毒性成分烏頭堿的毒代動(dòng)力學(xué)特征研究由于臨床上附子主要用于治療心動(dòng)過緩性心律不齊等慢性病,這增大了其產(chǎn)生毒性反應(yīng)的可能性,因此評(píng)價(jià)附子

4、的毒性,不僅要研究附子單次給藥毒代動(dòng)力學(xué)特征,對(duì)其長(zhǎng)期給藥的毒代動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行評(píng)價(jià)也是非常有必要的。在本課題的研究中,我們不僅完成了烏頭堿單次和長(zhǎng)期毒動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn),還對(duì)文獻(xiàn)從沒報(bào)道過的附子提取物的單次和多次給藥毒動(dòng)學(xué)特征進(jìn)行了比較。為此,我們建立了一種靈敏可靠的UPLC/MS/MS方法來測(cè)定血漿中烏頭堿的含量,確保結(jié)果準(zhǔn)確可靠。在此條件下進(jìn)行專屬性考察、線性范圍考察、精密度實(shí)驗(yàn)、準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)、回收率實(shí)驗(yàn)等一系列方法學(xué)考察。
　　 采用

5、大鼠后眼眶取血的方法分別完成大鼠烏頭堿靜脈注射毒代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)、烏頭堿長(zhǎng)期口服毒代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)、口服附子醇提物的單次和長(zhǎng)期毒代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)、口服附子總生物堿毒代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn),經(jīng)3P97藥動(dòng)學(xué)軟件處理,計(jì)算其毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
　　 3.烏頭堿血漿蛋白結(jié)合率的測(cè)定盡管烏頭堿的藥理作用和生物利用度測(cè)定已經(jīng)有人報(bào)道,但其血漿蛋白結(jié)合率特征至今鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。因此,本課題選用平衡透析法測(cè)定了烏頭堿的血漿蛋白結(jié)合率,這不僅利于闡明烏頭堿的藥效學(xué)性質(zhì),

6、同時(shí),對(duì)附子的生物活性特征也能產(chǎn)生更深刻的理解。
　　 二.烏頭堿體內(nèi)吸收特征研究采用大鼠在體腸灌流模型,測(cè)定烏頭堿在大鼠各個(gè)腸段的吸收率,研究烏頭堿體內(nèi)吸收特征。
　　 三.烏頭堿代謝特征研究文獻(xiàn)報(bào)道在大鼠體內(nèi)烏頭堿主要產(chǎn)生6種代謝產(chǎn)物,主要通過肝微粒體中細(xì)胞色素P450來催化完成。但對(duì)于烏頭堿在人體內(nèi)的CYP代謝途徑及產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的CYP同工酶未見報(bào)道。由于人體中90％的藥物是通過七種主要的CYP同工酶(CYP1A2

7、、2C9、2C8、2C19、2D6、2E1和3A4/5)代謝,因此我們運(yùn)用UPLC/MS/MS測(cè)定了重組人細(xì)胞色素P450酶對(duì)烏頭堿的代謝,建立烏頭堿CYP同工酶代謝特征譜,為烏頭堿和附子的毒性預(yù)警和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　 結(jié)果
　　 1.小鼠口服給藥烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿的LD50分別為3.17 mg/kg、2.11mg/kg和3.11 mg/kg；三種烏頭類生物堿的安全范圍都很狹窄,中烏頭堿和次烏頭堿的ED95

8、均大于LD5。。
　　 3.大鼠靜脈注射烏頭堿(40μg/kg)后其主要毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù):消除半衰期T1/2為80.98±6.40min,曲線下峰面積AUC(0-∞)為3201.89±338.91 ng·min·ml-1,烏頭堿在大鼠體內(nèi)的絕對(duì)生物利用度為8.31±0.89％。
　　 4.附子醇提物大鼠口服單次給藥和長(zhǎng)期給藥的主要毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù)AUC(0-∞)、MRT(0-∞)、CL、K、T1/2和Cmax無顯著性差異(P

9、>0.05),Tmax具有顯著性差異(P<0.05)。大鼠單次口服附子醇提物后,烏頭堿絕對(duì)生物利用度為4.72±2.66％。附子總生物堿大鼠口服單次給藥后,烏頭堿絕對(duì)生物利用度為5.79±0.82％,與附子醇提物單次給藥后烏頭堿絕對(duì)生物利用度相比,無顯著性差異。
　　 5.大鼠口服烏頭堿長(zhǎng)期給藥主要毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù)AUC(0-∞)、CL、T1/2、Cmax和Tmax與大鼠單次口服同劑量烏頭堿毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù)相比,均無顯著性差異(P>

10、0.05)。
　　 6.在5、20、50 ng·ml-1三個(gè)質(zhì)量濃度的烏頭堿血漿蛋白結(jié)合率分別為31.90％±1.69％、27.4％±1.71％和23.9％±2.51％。
　　 7.烏頭堿在大鼠各腸段的吸收率分別為十二指腸29.18±8.64％、空腸22.60±3.00％、回腸25.03±6.97％、結(jié)腸15.02±2.75％,滲透率分別為十二指腸1.30±0.38、空腸1.01±0.13、回腸1.11±0.31、結(jié)腸0

11、.67±0.12。
　　 8.P450同工酶是參與烏頭堿代謝的主要酶蛋白,其中M1由CYP2D6、2C8、3A4、3A5代謝產(chǎn)生,M2及M3由CYP2D6、2C9、3A4、3A5代謝產(chǎn)生,M4及M6由CYP2D6和CYP3A5產(chǎn)生,M5由CYP3A4和CYP3A5產(chǎn)生。
　　 結(jié)論
　　 1.烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿在小鼠體內(nèi)均能產(chǎn)生產(chǎn)生良好的鎮(zhèn)痛作用,但其半數(shù)致死量LD50值均較低,毒性較大,限制了其使用。<

12、br>　　 2.研究表明烏頭堿給藥、附子醇提物單次給藥和附子總生物堿單次給藥后按烏頭堿計(jì)算,其在大鼠體內(nèi)的絕對(duì)生物利用度(F)分別為8.31±0.89％、4.72±2.66％和5.79±0.82％,顯示烏頭堿在大鼠體內(nèi)生物利用度較低。烏頭堿單次給藥與多次給藥后毒動(dòng)學(xué)參數(shù)無顯著性差異說明烏頭堿在大鼠體內(nèi)代謝較快,經(jīng)過24h(約7個(gè)半衰期,ⅳ),烏頭堿在體內(nèi)殘留極少,無蓄積現(xiàn)象。大鼠附子醇提物單次或多次給藥后,AUC(0-∞)、MRT(0

13、-∞)、CL、K、T1/2和Cmax均無顯著性差異(P>0.05),而達(dá)峰時(shí)間 Tmax具有顯著性差異(P<0.05),可能與附子醇提物中所含其它成分在吸收時(shí)的相互作用有關(guān)。烏頭堿為低血漿蛋白結(jié)合率藥物,且濃度依賴性并不明顯,從結(jié)合態(tài)向游離態(tài)轉(zhuǎn)化耗時(shí)較少,主要以游離形式存在。
　　 3.烏頭堿在大鼠各腸段吸收量無差別,在15.02％至29.18％之間。烏頭堿在大鼠4段不同腸段的滲透率均較低,且無腸道差異,猜測(cè)可能原因?yàn)闉躅^堿在腸