環(huán)境因子對(duì)抗性基因消長動(dòng)力學(xué)及耐藥微生物群落結(jié)構(gòu)變化的影響研究.pdf

1、抗生素在醫(yī)藥、畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的大量使用造成環(huán)境中耐藥細(xì)菌及其抗性基因在環(huán)境中的傳播和擴(kuò)散，因此，近年來抗生素抗性基因作為一種新型環(huán)境污染物引起了研究者的廣泛關(guān)注。本文采集天津海河干流的水及底泥樣品，通過室內(nèi)模擬泥/水復(fù)合體系，研究了不同溫度、光照、有機(jī)質(zhì)等環(huán)境因子以及不同抗生素初始濃度對(duì)磺胺類抗性基因(sul1，sul2)及耐藥微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。模擬實(shí)驗(yàn)在人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行，設(shè)置2種溫度條件(20℃及4℃)、2種光照條件(24小

2、時(shí)黑暗條件及10000lux光照12/12h(開/關(guān))條件)及2種有機(jī)質(zhì)條件(高：40.94g/kg、低：28.06g/kg)。抗生素磺胺甲惡唑(SMX)濃度20℃下設(shè)置4組(未加SMX、10ug/L、80ug/L、20mg/L)、4℃下設(shè)置3組(未加SMX、10ug/L、20mg/L)，其中未加SMX為自然采集的泥水樣品。利用固相萃取(SPE)、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)及熒光定量PCR技術(shù)對(duì)模擬體系底泥中的磺胺甲惡唑(

3、SMX)及磺胺抗性基因(sul1，sul2)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測。
　　 模擬體系中磺胺甲惡唑的消減動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果顯示，SMX在20℃的降解速率常數(shù)k明顯大于4℃(0.041 d-1 vs0.011 d-1)，光照下的降解速率明顯大于黑暗條件，高有機(jī)質(zhì)組的降解速率明顯高于低有機(jī)質(zhì)組(光照：0.118 d-1(高有機(jī)質(zhì))vs0.069 d-1(低有機(jī)質(zhì))；黑暗：0.065 d-1(高有機(jī)質(zhì))vs0.041 d-1(低有機(jī)質(zhì)))，這表明

4、高溫、光照及高有機(jī)質(zhì)濃度均有利于磺胺甲惡唑的降解。
　　 采用抗性平板篩選可培養(yǎng)的耐藥細(xì)菌，耐藥率的動(dòng)力學(xué)變化表明，高溫(20℃)及高有機(jī)質(zhì)有利于可培養(yǎng)耐藥細(xì)菌的生長，光照條件下耐藥率呈消減趨勢(shì)，這與DGGE的結(jié)果一致，抗生素添加濃度為20mg/L組DGGE實(shí)驗(yàn)表明，高溫(20℃)及高有機(jī)質(zhì)促進(jìn)耐藥微生物的多樣性生長，光照條件對(duì)耐藥微生物多樣性影響不明顯。16S r-DNA基因序列分析鑒定出底泥中的優(yōu)勢(shì)可培養(yǎng)耐藥菌芽孢桿菌屬(B

5、acillus)，不用溫度、光照及有機(jī)質(zhì)下優(yōu)勢(shì)耐藥菌的具體種類有所不同，如4℃下優(yōu)勢(shì)耐藥菌為耐寒短桿菌(friqoritolerans)及堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)，20℃黑暗條件下為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、E海黃芽孢桿菌(Bacillus marisflavi)。DGGE條帶位置的明顯差異也表明不同溫度、光照及有機(jī)質(zhì)下耐藥微生物群落結(jié)構(gòu)差異明顯。
　　 采用PCR方法對(duì)模擬體系底泥中

6、的磺胺抗性基因進(jìn)行定性檢測，并通過Real-time PCR對(duì)兩種磺胺類抗性基因(sul1，sul2)及總細(xì)菌的16S r-DNA進(jìn)行定量分析?？股丶尤虢Msul基因的相對(duì)豐度(sul/16S r-DNA)較對(duì)照組均有所增加，表明抗生素對(duì)抗性基因的環(huán)境選擇性壓力。20℃下sul1/16S r-DNA，sul2/16Sr-DNA均明顯高于4℃，高有機(jī)質(zhì)組明顯高于低有機(jī)質(zhì)組，且sul2/16S r-DNA的增幅更明顯，表明高溫(20℃)及高