CKIP-1敲除對抗微重力環(huán)境下小鼠骨質(zhì)疏松機理研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　微重力環(huán)境下，骨量發(fā)生丟失，骨密度下降，骨力學(xué)性能降低，呈現(xiàn)出明顯的骨質(zhì)疏松癥狀。為消除這種影響，通常采用的措施是體育鍛煉和藥物治療，但這些措施并不能徹底消除微重力對骨質(zhì)疏松的影響。隨著載人航天技術(shù)的發(fā)展，會有越來越多的宇航員進入太空，因此，尋找有效的對抗微重力環(huán)境下骨質(zhì)疏松的措施非常有意義。作為骨形成負(fù)調(diào)控因子，CKIP-1的敲除能夠?qū)е鹿敲芏群凸橇匡@著增加。因此，可以嘗試采取CKIP-1基因敲除的方法對抗

2、微重力對骨代謝的影響。雖然空間飛行搭載實驗可以研究微重力對生物體的作用效應(yīng)，但其局限性很大。所以，常用尾懸吊動物模型來模擬地面上的微重力。另外，負(fù)責(zé)骨形成的成骨細胞起源于BMSCs，在微重力環(huán)境下，BMSCs怎樣定向向成骨分化？它與CKIP-1的敲除能夠?qū)е鹿橇吭黾佑惺裁绰?lián)系？因此，利用RCCS模擬微重力環(huán)境，也對BMSCs的成骨分化進行了研究。
　　本研究利用建立的小鼠尾懸吊模型，將WT小鼠和KO小鼠尾懸吊2w和4w后，比較不同

3、組別小鼠的骨質(zhì)疏松癥狀，以期揭示微重力環(huán)境下CKIP-1對骨骼成骨化和破骨化平衡的影響，為微重力所致骨質(zhì)疏松的治療提供一個新的思路。另外，研究微重力環(huán)境下BMSCs的成骨分化，有助于進一步研究CKIP-1敲除對BMSCs成骨化的影響，可以全面揭示微重力環(huán)境下骨的重建過程。
　　研究內(nèi)容與方法:
　　(1)小鼠尾懸吊微重力模型的建立。
　　參考大鼠尾懸吊模型，改進懸吊籠結(jié)構(gòu)，優(yōu)化懸吊條件，建立小鼠尾懸吊微重力模型。選取2

4、-3月齡C57BL/6J小鼠，雌雄隨機，利用醫(yī)用膠帶固定小鼠尾部，系于懸吊籠中進行尾部懸吊。調(diào)整高度，保證小鼠后肢離地，軀干與水平的角度約為30°，前肢能夠自由活動，能夠自由飲水和取食。選用與上述模型組相匹配的WT小鼠，正常條件下飼養(yǎng)，作為對照組。比較不同組別小鼠血清鈣離子、ALP和BGP濃度;Micro-CT掃描其股骨，比較骨微結(jié)構(gòu)相關(guān)參數(shù)的變化;用材料試驗機對其股骨進行三點彎曲試驗，比較力學(xué)相關(guān)參數(shù)的變化。
　　(2)微重力下

5、CKIP-1敲除對小鼠骨質(zhì)疏松癥狀的影響。
　　通過建立的小鼠尾懸吊模型，對WT小鼠和KO小鼠進行了2w和4w的尾懸吊實驗。分光光度法和ELISA法檢測了不同組別小鼠的血清ALP和BGP濃度變化;Micro-CT掃描其股骨的骨微結(jié)構(gòu)，比較了BV/TV、Tb.Pf、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp等反映骨小梁微觀結(jié)構(gòu)的參數(shù);HE染色和免疫組化實驗比較其股骨切片形態(tài)的差異;三點彎曲試驗檢測其股骨力學(xué)性能的變化，比較了斷裂位移、斷裂應(yīng)變

6、、斷裂載荷和斷裂能量等參數(shù);ELISA法檢測其血清成骨標(biāo)志物PⅠNF和破骨標(biāo)志物CTX-Ⅰ濃度的差異;RT-PCR和western blot比較其成骨相關(guān)基因和蛋白表達水平的差異。
　　(3)微重力對小鼠BMSCs成骨分化的影響。
　　采用密度梯度離心法，提取小鼠原代BMSCs，表面抗原細胞流式術(shù)鑒定其純度。在RCCS中模擬細胞培養(yǎng)微重力環(huán)境，加入成骨誘導(dǎo)劑培養(yǎng)14d，研究微重力環(huán)境下小鼠BMSCs成骨方向誘導(dǎo)的變化。分光光

7、度法檢測其細胞培養(yǎng)上清液ALP濃度的變化，試劑盒比較其細胞ALP染色水平的差異，western blot檢測其成骨相關(guān)蛋白表達水平的改變。
　　研究結(jié)果:
　　(1)建立小鼠尾懸吊模擬微重力模型。
　　與WT小鼠相比，TS小鼠血清中鈣離子濃度明顯升高、ALP和BGP濃度顯著降低;Micro-CT掃描結(jié)果證明其股骨的BV/TV下降、Tb.Pf上升、Tb.Th下降、Tb.N減少，而Tb.Sp上升;三點彎曲力學(xué)實驗也證明其股

8、骨的斷裂位移、斷裂應(yīng)變、斷裂載荷和斷裂能量均發(fā)生降低。與WT小鼠相比，TS小鼠無論生化指標(biāo)、股骨微觀結(jié)構(gòu)，還是股骨力學(xué)性能，均表現(xiàn)出明顯的骨質(zhì)疏松癥狀，證明所建立的微重力模型是成功的，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　(2)研究微重力下CKIP-1敲除對小鼠骨質(zhì)疏松癥狀的影響。
　　與未懸吊小鼠相比，懸吊組小鼠表現(xiàn)出明顯的骨質(zhì)疏松癥狀，無論是WT小鼠還是KO小鼠，并且骨質(zhì)疏松癥狀隨懸吊時間的延長而更加明顯，進一步證明實驗?zāi)Ｐ褪浅晒?/p>

9、的。具體表現(xiàn)為懸吊組小鼠血清ALP和BGP濃度水平降低;股骨骨小梁顯微結(jié)構(gòu)退化，骨微結(jié)構(gòu)更加松散;股骨切片HE染色和BGP免疫組化實驗顯示其成骨化程度更弱;股骨力學(xué)性能下降;血清成骨標(biāo)志物PⅠNF濃度下降，但破骨標(biāo)志物CTX-Ⅰ濃度基本保持不變;成骨相關(guān)基因和蛋白BMP-2、Col-Ⅰ和Runx2的表達水平顯著下降。
　　但在同等尾懸吊處理條件下，KO小鼠比WT小鼠血清ALP和BGP濃度更高;Micro-CT掃描表明其股骨BV/T

10、V升高、Tb.Pf下降、Tb.Th升高、Tb.N升高，而Tb.Sp下降，骨微結(jié)構(gòu)更加致密;股骨切片HE染色和股骨BGP免疫組化實驗顯示其成骨化程度更強;三點彎曲試驗反映其力學(xué)性能的相關(guān)參數(shù)更高，表明其股骨力學(xué)性能更好;血清成骨標(biāo)志物PⅠNF濃度更高，但破骨標(biāo)志物CTX-Ⅰ濃度相差不明顯;成骨相關(guān)基因和蛋白BMP-2、Col-Ⅰ和Runx2的表達水平明顯增高。以上實驗結(jié)果表明，在同等處理條件下，與WT小鼠相比，KO小鼠的骨質(zhì)疏松癥狀較輕一

11、些，充分證明了CKIP-1敲除對微重力的影響，說明CKIP-1敲除對微重力所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥具有一定的對抗作用。同時也證明，CKIP-1只是影響新骨的形成，而對骨骼的吸收幾乎沒有影響。
　　(3)研究微重力對小鼠BMSCs成骨分化的影響。
　　在成骨誘導(dǎo)液的誘導(dǎo)下，BMSCs向成骨方向分化明顯。而在RCCS模擬微重力培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)液中ALP濃度降低、BMSCs中ALP染色程度變淺、成骨相關(guān)蛋白BMP-2、BGP和Col-Ⅰ

12、的表達程度降低，證明微重力環(huán)境下BMSCs成骨化程度降低，微重力可以抑制BMSCs向成骨方向分化，為進一步研究微重力環(huán)境下CKIP-1基因敲除和高表達對BMSCs成骨方向分化的影響提供了參考。
　　結(jié)論:
　　成功建立小鼠尾懸吊模擬微重力模型。同等尾懸吊條件下，多方面研究發(fā)現(xiàn)KO小鼠比WT小鼠表現(xiàn)出較輕的骨質(zhì)疏松癥狀，證明CKIP-1敲除可以部分對抗微重力對小鼠骨質(zhì)疏松的影響，為骨質(zhì)疏松的治療提供了一種新的思路。但這種影響只