楊樹莖尖小RNA組學和種子萌發(fā)技術研究.pdf

1、楊樹易繁殖、生長迅速，是世界上廣泛栽培的重要用材樹種。楊樹全基因組已被測序，成為林木科學研究的模式樹種。林木地上部分的生長主要來自于莖尖分生組織(shoot apicalmeristems，SAM)的發(fā)育分化。莖尖分生組織是位于植物頂端具有持續(xù)分化能力的組織，通過細胞分裂、分化產生莖、葉和花等器官。植物莖尖分生組織的分化進程由復雜的基因網(wǎng)絡調控，目前關于木本植物的SAM研究主要集中在激素和轉錄水平調控，而有關SAM轉錄后水平研究尚未見報

2、道。miRNAs是一類重要的轉錄后水平調控因子，其參與SAM生長發(fā)育的相關調控機制卻不清楚。本研究中，以毛白楊(Populus tomentosa)不同生長階段的莖尖分生組織為主要研究對象，以莖尖分化形成的葉片為對照，采用高通量測序方法構建莖尖分生組織和葉片的小RNA數(shù)據(jù)庫，進行比較研究分析。此外，除莖尖分生組織外，種子萌發(fā)是林木樹種生長發(fā)育以及有性繁殖的重要基礎，然而不同外界因素對楊樹種子萌發(fā)影響的研究報道卻較少。因此，本論文也研究了

3、不同外界環(huán)境因素對楊樹種子萌發(fā)的影響。主要結果如下:
　　(1)在莖尖和葉片中分別獲得11，321，446和11，926，435個clean reads，文庫中的小RNA序列長度主要分布18nt到30nt之間，且主峰值在21nt處，符合被子植物典型miRNAs長度分布。
　　(2)比對miRBase數(shù)據(jù)庫分別獲得莖尖和葉片中已知miRNAs共計231和256種。同時，在楊樹莖尖和葉片中，分別預測到185和181個新miRNA

4、s。
　　(3)根據(jù)楊樹全基因組序列、應用生物信息學網(wǎng)站程序psRobot和TargetFinder進行靶基因預測。結果表明，已知miRNAs預測到1796個靶基因，新miRNAs預測到1507個靶基因。這些靶基因的功能均主要集中在蛋白結合、細胞進程和催化活性等通路上。
　　(4)對于差異表達miRNAs的分析，與葉片比較，已知miRNAs中莖尖上調的有14個，下調的有54個;新miRNAs中莖尖上調的有27個，下調的有30

5、個。進一步對差異表達miRNAs的靶基因進行功能注釋，結果表明已知miRNAs中莖尖表達量上調miRNAs的靶基因功能主要集中在光敏色素互作、葉片著色和葉形態(tài)建成等途徑;莖尖表達量下調miRNAs的靶基因功能主要集中在細胞分裂分化、生長素響應和細胞分裂素響應等與激素響應有關的途徑。同時，新miRNAs中莖尖表達量上調miRNAs的靶基因功能主要集中在捕光葉綠素合成和葉綠素酸酯a加氧酶等與光合作用相關的的途徑;莖尖表達量下調miRNAs的

6、靶基因功能主要集中在RNA聚合酶等途徑。這些結果表明，莖尖在發(fā)育過程中，可通過激素相關miRNAs負向調控其靶基因，進而影響植株的生長發(fā)育。
　　(5)ptc-miR166家族成員中ptc-miR166n、ptc-miR166o和ptc-miR166q在莖尖分生組織中均顯著下調，并靶向多個與細胞分裂分化相關的Ⅲ型HD-ZIP(classⅢHOMEODOMAIN-LEUCINE ZIPPER)轉錄因子家族成員。進一步進行qRT-PC

7、R實驗發(fā)現(xiàn)，ptc-miR166及其靶基因HD-ZIP在分化過程中，表達量呈現(xiàn)出相反趨勢，表明HD-ZIP可能是ptc-miR166的目標靶基因，ptc-miR166通過負反饋調控HD-ZIP轉錄因子在莖尖分生組織中起到重要調控作用。
　　(6)ptc-miR393家族成員中ptc-miR393a、ptc-miR393b和ptc-miR393c在莖尖中均顯著下調，并靶向多個與生長素響應相關的TRI1(transport inhib

8、itor responseⅠ)轉錄因子。熒光定量結果表明，ptc-miR393及其靶基因TRI1在發(fā)育過程中，表達量呈現(xiàn)出相反趨勢，說明TRI1可能是ptc-miR393的目標靶基因，ptc-miR393通過負反饋調控TRI1轉錄因子在生長素響應過程中起到關鍵作用。
　　(7)以毛白楊種子為實驗材料，研究不同溫度、鹽分、pH值和光照強度對毛白楊種子萌發(fā)的影響。毛白楊種子在晝夜溫度為23℃/18℃時，種子發(fā)芽率最高。同時，種子發(fā)芽能

9、力明顯受鹽脅迫影響，發(fā)芽率隨鹽濃度的增加而下降。此外，酸堿度也可影響種子萌發(fā)，種子在中性環(huán)境下萌發(fā)率最高。在一定光照強度下，種子的發(fā)芽率會隨著光照強度的增加而增加，表明光照促進種子的萌發(fā)。
　　本研究以毛白楊莖尖分生組織和葉片為材料，建立了兩個小RNA文庫，篩選出差異表達的miRNAs，并且結合預測獲得的靶基因及靶基因功能注釋，運用熒光定量PCR技術，研究了miRNAs與預測靶基因的表達關系及其在毛白楊莖尖分化與發(fā)育過程中的功能。