水曲柳種子脫水耐性蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究.pdf

1、脫水耐性是正常型種子完成體內(nèi)水分相對適度平衡的一種能力。是在儲藏或環(huán)境脅迫中能夠存活、保證物種更好繁衍的一種適應(yīng)性策略。在低溫和干旱脅迫條件下，理解正常型種子如何對脫水的反應(yīng)是提高種子質(zhì)量和種子長期保存的前提條件。不同類型的種子脫水敏感性不盡相同，它直接影響到種子的儲藏和種質(zhì)資源的保存，因而種子脫水耐性的研究在理論和實踐上都具有重要的意義。種子脫水耐性問題一直是種子生理學(xué)研究中比較熱門的問題，但到目前為止對種子脫水耐性的分子調(diào)控機制的研

2、究還處于探索階段。本研究以東北地區(qū)重要闊葉用材樹種水曲柳的種子為試驗材料，利用水曲柳已解除休眠種子的再干燥脫水過程來研究種子脫水耐性的分子機制，采用分子生物學(xué)中蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的試驗技術(shù)，研究篩選在不同條件下（20℃;20℃硅膠處理;1℃;1℃用Ca2+處理）相對含水量為10％時種子的差異蛋白。不同條件下提取脫水的種子蛋白，通過2D-DIGE技術(shù)分離蛋白質(zhì)，然后通過質(zhì)譜進行鑒定。在凝膠上總共發(fā)現(xiàn)2919個蛋白點，具有顯著性差異的蛋白

3、點為27個，使用MALDI TOF/TOF質(zhì)譜儀成功鑒定出7個差異蛋白，其中6個蛋白是上調(diào)，1個蛋白是下調(diào)。特別是驅(qū)動蛋白-1在低溫脅迫下表現(xiàn)為上調(diào)，驅(qū)動蛋白-1除了在擬南芥中被發(fā)現(xiàn)外，很少在植物中被發(fā)現(xiàn)，這個蛋白與微管運動的有關(guān)，影響和調(diào)控動態(tài)生長及微管的聚集，同時提供微管和其它細胞間的結(jié)構(gòu)連接，對調(diào)控微管的冷穩(wěn)定性起到了很重要的作用。
　　在種子發(fā)育過程中，脫水耐性被嚴格的控制，可是在正常型種子中確定種子的脫水耐性很難達到一個

4、統(tǒng)一的機制。原因是種子對水分缺失的反應(yīng)相當復(fù)雜。因此，從分子角度上應(yīng)當分析和比較與脫水耐性相關(guān)的基因。轉(zhuǎn)錄調(diào)控是通過轉(zhuǎn)錄因子和特殊元件相互作用來進行調(diào)解的，而新一代測序技術(shù)的應(yīng)用能夠確定基因序列和轉(zhuǎn)錄本，甚至在沒有參考基因的情況下允許基因表達模式的大量分析。
　　我們在水曲柳種子中獲得了大約8千萬個reads，從頭組裝產(chǎn)生了52，992個高質(zhì)量的unigenes序列，平均長度為383 bp。其中44，251 unigenes被成功

5、注釋到公共蛋白數(shù)據(jù)庫中，其中218和脫水耐性相關(guān)。在三個不同處理的樣本中分析鑒定出顯著差異的1，231個轉(zhuǎn)錄本。在每個處理中根據(jù)功能對unigene進行了分類，這些數(shù)據(jù)對水曲柳種子將來進一步的研究提供了豐富的數(shù)據(jù)來源。最后，我們預(yù)測到了1，683個單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其中在20℃和1℃兩個處理之間顯示出649個多態(tài)性位點，在1℃和1℃鈣處理兩個樣本之間顯示出1034個多態(tài)性位點。本試驗中，我們使用了Solexa技術(shù)平臺建立了水曲柳

6、種子不同處理條件下轉(zhuǎn)錄組。
　　從水曲柳轉(zhuǎn)錄組中我們鑒定了包括Zinc finger、NAC、Cytochrome P450、Protease、WRKY、MYB、bZIP、ERF、Lipase、AP2/ERF、ARF、RINGfinger、CIPK、DREB、bHLH、Pathogen-related protein、MADS-box等17轉(zhuǎn)錄因子家族。我們發(fā)現(xiàn)20℃、1℃和鈣處理1℃的水曲柳種子三個樣本之間轉(zhuǎn)錄因子家族中許多基因

7、的表達發(fā)生不同程度的變化，說明多種轉(zhuǎn)錄因子家族共同參與了水曲柳的脫水和低溫下脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。表達譜分析結(jié)果顯示，在各轉(zhuǎn)錄因子家族中，Zinc finger基因家族的脅迫應(yīng)答基因數(shù)量最多，其次是Protease、NAC、ERF、bZIP、Cytochrome P450、MYB基因家族。對NAC、WRKY、MYB家族基因聚類分析發(fā)現(xiàn)，多數(shù)基因的表達受低溫脫水脅迫誘導(dǎo)，NAC、WRKY、MYB家族中鈣處理后的基因表達模式表現(xiàn)為上調(diào)，說明鈣在低

8、溫脫水應(yīng)答中發(fā)揮了重要的作用。其它處理中表達模式并不相同，說明同一個轉(zhuǎn)錄因子家族不同成員有可能參與了水曲柳對低溫脫水耐性響應(yīng)的調(diào)控，或者在相同處理應(yīng)答中發(fā)揮不同的作用。通過進一步分析表明，本試驗顯著富集的幾個通路中涉及到分子伴侶和折疊催化（chaperones and folding catalysts），MAPK信號通路(mitogen-activated protein kinase signaling pathway)和在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中