Fe3O4納米顆粒對細胞低溫保存過程傳遞現(xiàn)象的影響及其應用.pdf

1、細胞、組織或者器官可以在低溫下長期保存，但卻極易在添加/去除低溫保護劑、降溫以及復溫過程中遭受損傷而導致死亡。細胞在冷凍過程中遭受的低溫損傷主要是滲透壓超過細胞承受范圍導致的溶液損傷和細胞內(nèi)外溶液中冰晶的形成和生長、冰晶再結晶、玻璃化與反玻璃化等胞內(nèi)冰損傷。納米材料由于具有優(yōu)良的導熱性，抑制冰晶的形成和生長、增強降溫速率、促進溶液玻璃化的轉(zhuǎn)變等特性，可以應用于低溫保存中降低低溫損傷。我們研究了Fe3O4納米顆粒對于低溫保護劑添加/去除過

2、程以及冷凍過程中傳遞現(xiàn)象的影響，并且利用Fe3O4納米顆粒的電磁感應加熱輔助玻璃化凍存的復溫。
　　本文首先設計并改進了微灌流腔系統(tǒng)，開發(fā)了一種更簡便易用的微灌流顯微鏡裝置用以測量細胞膜的滲透性參數(shù)。并且測定豬脂肪干細胞(pADSC)在不同溫度下高滲磷酸鹽緩沖鹽水以及低溫保護劑中細胞滲透響應過程，使用2-p模型擬合得到pADSCs的滲透系數(shù)。我們測定pADSCs的非滲透性體積（Vb），以及在不同溫度下水的滲透系數(shù)（Lp），和CPA

3、滲透率（Ps），然后定量分析溫度對pADSC膜的傳輸性質(zhì)的影響。根據(jù)得到的滲透參數(shù)進行優(yōu)化CPA添加/去除過程，以降低低溫保存過程中細胞的過度收縮造成的損傷。并且我們使用微灌流顯微鏡系統(tǒng)測定了Sf21細胞在25，15，5和-2℃下滲透響應過程，分別使用兩者的K-K模型和2-p模型擬合體積變化過程，并比較了兩種模型擬合的結果。本文以Sf21細胞為模型，發(fā)現(xiàn)Lp滲透系數(shù)在參考溫度的數(shù)值(Lpg)與CPA的摩爾濃度線性，由此我們得到Sf21細

4、胞膜的滲透系數(shù)對于溫度和低溫保護劑具有雙重依賴的特定，并拓展了Arrhenius關系，最終結果驗證了拓展后Arrhenius公式與實驗數(shù)據(jù)非常符合。此后，我們測定了Fe3O4納米顆粒對于細胞膜的滲透系數(shù)影響，使用微灌流腔系統(tǒng)測量了在25，15，5和-2℃下不同濃度氧化鐵納米顆粒對Sf21細胞滲透響應的影響，并且使用2-p模型擬合了相應的體積變化過程，得到細胞膜的滲透參數(shù)。通過測量不同濃度氧化鐵納米顆粒對Sf21細胞滲透參數(shù)的影響，發(fā)現(xiàn)氧

5、化鐵納米顆粒明顯改變細胞膜對于水的滲透參數(shù)。這些結果表明納米顆粒加入后，Lp對于溫度的敏感性顯著降低，而納米濃度的增加沒有對Lp的溫度敏感性產(chǎn)生很大的影響。同時，納米顆粒的加入顯著增加了Lpg，說明在0℃下Lp數(shù)值明顯增加，而隨著納米顆粒濃度的增加，在0℃下Lp數(shù)值沒有明顯增加。
　　為了研究Fe3O4納米顆粒對低溫冷凍中水輸運和胞內(nèi)冰形成的影響，通過低溫顯微鏡我們測試了納米顆粒對水輸運和胞內(nèi)冰形成的影響。定量分析了人臍帶血內(nèi)皮細

6、胞（HUVECs）對Fe3O4納米顆粒的攝入，并且使用透射電子顯微鏡(TEM)確定納米顆粒進入HUVECs細胞內(nèi)。利用低溫顯微鏡測定了在不同的冷卻速度下HUVECs細胞的水輸運和胞內(nèi)冰現(xiàn)象，并通過水輸運模型和胞內(nèi)冰概率模型，擬合得到水滲透參數(shù)(Lpg，ELp)和胞內(nèi)冰的形成概率參數(shù)(Ω2，κ)。定量分析了Fe3O4納米顆粒在細胞外溶液中和在細胞內(nèi)對水的滲透性和細胞內(nèi)冰形成的影響。結果表明，F(xiàn)e3O4納米顆粒改善了凍結過程中水的運輸，并且

7、促進胞內(nèi)冰的形成。這些重要的實驗數(shù)據(jù)為HUVEC納米冷凍保存提供了基礎。
　　為了解決復溫過程中遇到的復溫速率慢和溫度不均勻等問題，我們探索了利用超順磁性納米顆粒的電磁感應加熱作用輔助復溫玻璃化冷凍的生物樣品。我們使用共沉淀法合成了超順磁性Fe3O4納米顆粒并且對其進行表征，研究了Fe3O4納米顆粒對于細胞玻璃化凍存的作用，并且使用電磁感應加熱復溫玻璃化冷凍的生物樣品，優(yōu)化了復溫的條件并系統(tǒng)測定了復溫后生物樣品的存活率和生物功能等

8、重要的指標。我們檢測了超順磁性Fe3O4納米顆粒的細胞攝入以及對人臍帶血干細胞(hUCM-MSC)增值的影響。結果表明，超順磁性Fe3O4納米顆粒可以進入到細胞內(nèi)，并且少量的Fe3O4納米顆粒對hUCM-MSC細胞增值沒有影響。并且我們研究了超順磁性Fe3O4納米顆粒對低溫冷凍保護液的玻璃化狀態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)沒有電磁加熱的Fe3O4納米顆粒對hUCM-MSC的玻璃化冷凍保存過程中沒有顯著影響，而復溫過程中通過交變磁場加熱Fe3O4納米顆粒