骶叢神經(jīng)撕脫傷的臨床治療與實驗研究.pdf

1、由于現(xiàn)代交通與工業(yè)的迅猛發(fā)展，各種高能量創(chuàng)傷導致的骨盆骨折發(fā)生率逐年增加。骶骨骨折或骶髂關節(jié)脫位等骨盆后環(huán)的不穩(wěn)定損傷極易伴發(fā)骶神經(jīng)損傷，發(fā)生率高達56.8％。骶叢神經(jīng)損傷可能導致患者下肢運動及感覺功能障礙，同時可能出現(xiàn)膀胱及性功能不全。傳統(tǒng)治療手段為保守治療或骨折切開復位內(nèi)固定及神經(jīng)減壓，但效果不佳，尤其是當骶叢神經(jīng)出現(xiàn)根性撕脫傷時其治療更加困難棘手，長久以來一直是骨科亟待解決的臨床難題。雖然近年有少數(shù)手術方法修復骶叢損傷嘗試，但最終

2、僅取得下肢功能少部分恢復。課題組前期在獼猴的動物實驗中已經(jīng)證實切斷腰6（即人類骶1）神經(jīng)根的安全性及健側(cè)腰6神經(jīng)根移位修復骶叢撕脫傷的有效性，在此基礎上，我們研究了骶1神經(jīng)根在人類下肢主要骨骼肌的神經(jīng)支配情況，發(fā)現(xiàn)骶1神經(jīng)根主要支配臀中肌、臀大肌、股二頭肌、腓骨長肌、腓腸肌內(nèi)側(cè)頭、腓腸肌外側(cè)頭及趾短伸肌，其對下肢主要骨骼肌的神經(jīng)支配均可通過腰4，腰5，骶2和骶3神經(jīng)根代償，其神經(jīng)支配所占比重最大為腓腸肌外側(cè)頭51.38％。我們最終通過臨

3、床、電生理等多種檢測手段證實了健側(cè)骶1神經(jīng)根移位修復單側(cè)骶叢撕脫傷對健側(cè)肢體的安全性及對患側(cè)肢體功能恢復的有效性。
　　另外，課題組前期在對大鼠骶叢撕脫傷的研究中發(fā)現(xiàn)，脊髓前角神經(jīng)元的死亡是影響修復效果的主要原因，因此研究脊髓前角神經(jīng)元死亡的機制，對于提高脊髓前角神經(jīng)元的存活率，改善骶叢撕脫損傷療效有著關鍵作用。細胞死亡主要分為壞死和程序性的細胞死亡，而程序性細胞死亡又主要分為兩種，Ⅰ型為細胞凋亡，Ⅱ型是自噬性細胞死亡，課題組前期

4、實驗已經(jīng)證實骶叢神經(jīng)撕脫后，脊髓前角神經(jīng)元可發(fā)生明顯凋亡，且脊髓前角神經(jīng)元的凋亡隨時間上升程度遠不及其存活率下降程度，分析此過程可能存在自噬等其他細胞死亡方式。我們通過在體實驗首次明確大鼠骶叢撕脫傷后脊髓前角神經(jīng)元發(fā)生自噬并證實外源性HMGB1是其發(fā)生的誘因，另外，體外實驗發(fā)現(xiàn)重組HMGB1可以誘導脊髓原代神經(jīng)元發(fā)生自噬，HMGB1主要通過ERK和JNK通路對神經(jīng)元自噬起調(diào)控作用，神經(jīng)元的自噬在氧糖剝奪模擬的損傷環(huán)境下對其存活起保護作用

5、。本研究結(jié)果對骶叢神經(jīng)根性撕脫傷這一病理生理過程提供了更為全面深入的認識，將有望提高骶叢撕脫傷后脊髓前角神經(jīng)元的存活率，最終改善骶叢損傷修復療效。
　　第一部分 健側(cè)骶1神經(jīng)根移位修復單側(cè)骶叢神經(jīng)撕脫傷的臨床研究
　　目的:
　　評估健側(cè)骶1神經(jīng)根作為動力源神經(jīng)移位修復單側(cè)骶叢神經(jīng)撕脫傷的安全性及有效性。
　　方法:
　　本研究納入兩組患者，第一組包括15例骶骨骨折伴有單側(cè)骶叢神經(jīng)損傷的患者，術前的體格檢查

6、、肌電圖檢查、磁共振及CT檢查均證實患者健側(cè)下肢的感覺運動功能完全正常，手術方法為腰4-骶4椎板減壓及腰骶固定，同時對患者健側(cè)的腰4-骶4神經(jīng)根進行電刺激，記錄下肢主要骨骼肌的動作電勢，明確骶1神經(jīng)根在下肢主要骨骼肌的神經(jīng)支配情況。第二組包括6例單側(cè)骶叢撕脫傷患者，手術方法為將健側(cè)骶1神經(jīng)根切斷后與患側(cè)臀下神經(jīng)和坐骨神經(jīng)股二頭肌肌支吻合，同時取患側(cè)的腓總神經(jīng)做神經(jīng)移植。
　　結(jié)果:
　　第一組結(jié)果顯示骶1神經(jīng)根主要參與臀中肌

7、、臀大肌、股二頭肌、腓骨長肌、腓腸肌內(nèi)側(cè)頭、腓腸肌外側(cè)頭及趾短伸肌的神經(jīng)支配，其對下肢主要骨骼肌的神經(jīng)支配均可通過腰4，腰5，骶2和骶3神經(jīng)根代償，其神經(jīng)支配所占比重最大為腓腸肌外側(cè)頭51.38％。第二組患者在術后均發(fā)現(xiàn)健側(cè)足底的麻木及肌力的輕度下降，但這些癥狀逐漸消失，健側(cè)肢體的神經(jīng)電生理結(jié)果基本正常，但坐骨神經(jīng)感覺誘發(fā)電位略降低，感覺定量檢測可見患者在骶1神經(jīng)根所支配的皮區(qū)上可見振動覺閾值明顯升高，其余感覺未見明顯差異?；紓?cè)髖外展肌

8、力及膝關節(jié)屈曲肌力增加到Ⅲ級。
　　結(jié)論:
　　健側(cè)骶1神經(jīng)根移位修復單側(cè)骶叢神經(jīng)就臨床評估和電生理檢測結(jié)果來說是安全有效的。因此，骶1神經(jīng)根是治療單側(cè)腰骶叢神經(jīng)撕脫傷的合適動力源神經(jīng)。
　　第二部分 大鼠骶叢神經(jīng)撕脫傷后脊髓前角神經(jīng)元自噬表達及機制研究
　　目的:
　　1、研究大鼠單側(cè)骶叢撕脫傷后患側(cè)脊髓前角神經(jīng)元的自噬表達規(guī)律及其與外源性HMGB1關系。2、研究外源性HMGB1誘導大鼠原代脊髓神經(jīng)元發(fā)生

9、自噬及機制。3、研究HMGB1誘導自噬在損傷環(huán)境下對大鼠原代脊髓神經(jīng)元的生物學意義。
　　方法:
　　1、選用成年雄性SD大鼠30只(體重200-220g)，將其隨機分為5組，每組6只，首先建立單側(cè)腰4-腰6骶叢撕脫傷模型。分別于損傷后0小時，4小時，1天，3天，7天處死后取相應節(jié)段脊髓。分別觀察以下指標:①利用透射電鏡觀察脊髓前角自噬小體等結(jié)構。②利用免疫印跡法檢測自噬相關蛋白LC3-Ⅱ及p62的表達情況。③利用免疫熒光法

10、檢測自噬相關蛋白LC3-Ⅱ及神經(jīng)元特異性標記物NeuN的表達情況。再選用成年雄性SD大鼠10只(體重200-220g)，將其隨機分為2組，每組5只。A組:撕脫+對照IgY抗體組，B組:撕脫+HMGB1中和抗體組。A組首先在腹腔內(nèi)注射對照IgY抗體（2μg/Kg），然后建立單側(cè)腰4-腰6骶叢撕脫傷模型，B組首先在腹腔內(nèi)注射HMGB1中和抗體（2μg/Kg），然后建立單側(cè)腰4-腰6骶叢撕脫傷模型，均于損傷后1天處死取相應節(jié)段脊髓。分別觀察以

11、下指標:①利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中HMGB1表達情況。②利用免疫熒光法檢測相應節(jié)段脊髓中HMGB1的表達情況。③透射電鏡觀察脊髓前角自噬小體等結(jié)構。④利用免疫印跡法檢測自噬相關蛋白LC3-Ⅱ及p62的表達情況。⑤利用免疫熒光法檢測自噬相關蛋白LC3-Ⅱ及神經(jīng)元特異性標記物NeuN的表達情況。
　　2、①取培養(yǎng)第7天的SD大鼠原代脊髓神經(jīng)元細胞，加入重組HMGB1(1μg/ml)，分別于0小時、6小時、12小時、24小時、36小

12、時和48小時，利用免疫印跡法檢測自噬相關蛋白LC3-Ⅱ及p62的表達情況，利用細胞免疫熒光法檢測自噬相關蛋白LC3-Ⅱ表達情況。②取培養(yǎng)第7天的SD大鼠原代脊髓神經(jīng)元細胞，加入重組HMGB1(1μg/ml)，分別于0小時、3小時、6小時、12小時、24小時，利用免疫印跡法檢測p-JNK，total-JNK，p-ERK，total-ERK，p-p38的表達情況。③取培養(yǎng)第7天的SD大鼠原代脊髓神經(jīng)元細胞首先分別加入SB（10μM）、SP（

13、20μM）和PD(20μM)處理1小時，然后加入重組HMGB1(1μg/ml)處理36小時，利用免疫印跡法檢測自噬相關蛋白LC3-Ⅱ表達情況。④取培養(yǎng)第7天的SD大鼠原代脊髓神經(jīng)元細胞，A組:對照組，B組:HMGB1干預組，C組:氧糖剝奪干預組（1小時或4小時），D組:HMGB1+氧糖剝奪干預組（1小時或4小時），E組:HMGB1+氧糖剝奪（1小時或4小時）+氯喹干預組。cck-8活力測定檢測神經(jīng)元存活率。
　　結(jié)果:
　　

14、1、單側(cè)骶叢撕脫傷后患側(cè)脊髓前角電鏡下可見大量自噬小體，免疫印跡及免疫熒光檢測均可見自噬相關蛋白高表達，撕脫傷后4小時和1天強度最高。A組血清及脊髓中HMGB1表達水平顯著高于B組，電鏡觀察可見A組脊髓前角自噬小體數(shù)量大于B組，免疫印跡及免疫熒光檢測均可見A組自噬相關蛋白表達水平高于B組。
　　2、重組HMGB1顯著提高原代脊髓神經(jīng)元細胞的自噬相關蛋白表達，處理后36h表達最高。重組HMGB1激活原代脊髓神經(jīng)元細胞ERK、JNK和

15、p38 MAPK， ERK和JNK通路阻滯劑可降低自噬相關蛋白表達。HMGB1誘導的自噬在氧糖剝奪環(huán)境下提高細胞存活率，自噬阻滯劑氯喹預處理后顯著降低細胞存活率。
　　結(jié)論:
　　單側(cè)骶叢撕脫傷后患側(cè)脊髓前角神經(jīng)元發(fā)生自噬，撕脫傷后4小時和1天為表達最高。 HMGB1中和抗體可顯著降低骶叢撕脫傷后患側(cè)脊髓前角神經(jīng)元自噬表達。重組HMGB1可誘導原代脊髓神經(jīng)元細胞的自噬表達，并通過ERK和JNK通路參與自噬調(diào)控。 HMGB1誘