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文檔簡介
1、由于現(xiàn)代交通與工業(yè)的迅猛發(fā)展,各種高能量創(chuàng)傷導致的骨盆骨折發(fā)生率逐年增加。骶骨骨折或骶髂關節(jié)脫位等骨盆后環(huán)的不穩(wěn)定損傷極易伴發(fā)骶神經(jīng)損傷,發(fā)生率高達56.8%。骶叢神經(jīng)損傷可能導致患者下肢運動及感覺功能障礙,同時可能出現(xiàn)膀胱及性功能不全。傳統(tǒng)治療手段為保守治療或骨折切開復位內(nèi)固定及神經(jīng)減壓,但效果不佳,尤其是當骶叢神經(jīng)出現(xiàn)根性撕脫傷時其治療更加困難棘手,長久以來一直是骨科亟待解決的臨床難題。雖然近年有少數(shù)手術方法修復骶叢損傷嘗試,但最終
2、僅取得下肢功能少部分恢復。課題組前期在獼猴的動物實驗中已經(jīng)證實切斷腰6(即人類骶1)神經(jīng)根的安全性及健側(cè)腰6神經(jīng)根移位修復骶叢撕脫傷的有效性,在此基礎上,我們研究了骶1神經(jīng)根在人類下肢主要骨骼肌的神經(jīng)支配情況,發(fā)現(xiàn)骶1神經(jīng)根主要支配臀中肌、臀大肌、股二頭肌、腓骨長肌、腓腸肌內(nèi)側(cè)頭、腓腸肌外側(cè)頭及趾短伸肌,其對下肢主要骨骼肌的神經(jīng)支配均可通過腰4,腰5,骶2和骶3神經(jīng)根代償,其神經(jīng)支配所占比重最大為腓腸肌外側(cè)頭51.38%。我們最終通過臨
3、床、電生理等多種檢測手段證實了健側(cè)骶1神經(jīng)根移位修復單側(cè)骶叢撕脫傷對健側(cè)肢體的安全性及對患側(cè)肢體功能恢復的有效性。
另外,課題組前期在對大鼠骶叢撕脫傷的研究中發(fā)現(xiàn),脊髓前角神經(jīng)元的死亡是影響修復效果的主要原因,因此研究脊髓前角神經(jīng)元死亡的機制,對于提高脊髓前角神經(jīng)元的存活率,改善骶叢撕脫損傷療效有著關鍵作用。細胞死亡主要分為壞死和程序性的細胞死亡,而程序性細胞死亡又主要分為兩種,Ⅰ型為細胞凋亡,Ⅱ型是自噬性細胞死亡,課題組前期
4、實驗已經(jīng)證實骶叢神經(jīng)撕脫后,脊髓前角神經(jīng)元可發(fā)生明顯凋亡,且脊髓前角神經(jīng)元的凋亡隨時間上升程度遠不及其存活率下降程度,分析此過程可能存在自噬等其他細胞死亡方式。我們通過在體實驗首次明確大鼠骶叢撕脫傷后脊髓前角神經(jīng)元發(fā)生自噬并證實外源性HMGB1是其發(fā)生的誘因,另外,體外實驗發(fā)現(xiàn)重組HMGB1可以誘導脊髓原代神經(jīng)元發(fā)生自噬,HMGB1主要通過ERK和JNK通路對神經(jīng)元自噬起調(diào)控作用,神經(jīng)元的自噬在氧糖剝奪模擬的損傷環(huán)境下對其存活起保護作用
5、。本研究結(jié)果對骶叢神經(jīng)根性撕脫傷這一病理生理過程提供了更為全面深入的認識,將有望提高骶叢撕脫傷后脊髓前角神經(jīng)元的存活率,最終改善骶叢損傷修復療效。
第一部分 健側(cè)骶1神經(jīng)根移位修復單側(cè)骶叢神經(jīng)撕脫傷的臨床研究
目的:
評估健側(cè)骶1神經(jīng)根作為動力源神經(jīng)移位修復單側(cè)骶叢神經(jīng)撕脫傷的安全性及有效性。
方法:
本研究納入兩組患者,第一組包括15例骶骨骨折伴有單側(cè)骶叢神經(jīng)損傷的患者,術前的體格檢查
6、、肌電圖檢查、磁共振及CT檢查均證實患者健側(cè)下肢的感覺運動功能完全正常,手術方法為腰4-骶4椎板減壓及腰骶固定,同時對患者健側(cè)的腰4-骶4神經(jīng)根進行電刺激,記錄下肢主要骨骼肌的動作電勢,明確骶1神經(jīng)根在下肢主要骨骼肌的神經(jīng)支配情況。第二組包括6例單側(cè)骶叢撕脫傷患者,手術方法為將健側(cè)骶1神經(jīng)根切斷后與患側(cè)臀下神經(jīng)和坐骨神經(jīng)股二頭肌肌支吻合,同時取患側(cè)的腓總神經(jīng)做神經(jīng)移植。
結(jié)果:
第一組結(jié)果顯示骶1神經(jīng)根主要參與臀中肌
7、、臀大肌、股二頭肌、腓骨長肌、腓腸肌內(nèi)側(cè)頭、腓腸肌外側(cè)頭及趾短伸肌的神經(jīng)支配,其對下肢主要骨骼肌的神經(jīng)支配均可通過腰4,腰5,骶2和骶3神經(jīng)根代償,其神經(jīng)支配所占比重最大為腓腸肌外側(cè)頭51.38%。第二組患者在術后均發(fā)現(xiàn)健側(cè)足底的麻木及肌力的輕度下降,但這些癥狀逐漸消失,健側(cè)肢體的神經(jīng)電生理結(jié)果基本正常,但坐骨神經(jīng)感覺誘發(fā)電位略降低,感覺定量檢測可見患者在骶1神經(jīng)根所支配的皮區(qū)上可見振動覺閾值明顯升高,其余感覺未見明顯差異?;紓?cè)髖外展肌
8、力及膝關節(jié)屈曲肌力增加到Ⅲ級。
結(jié)論:
健側(cè)骶1神經(jīng)根移位修復單側(cè)骶叢神經(jīng)就臨床評估和電生理檢測結(jié)果來說是安全有效的。因此,骶1神經(jīng)根是治療單側(cè)腰骶叢神經(jīng)撕脫傷的合適動力源神經(jīng)。
第二部分 大鼠骶叢神經(jīng)撕脫傷后脊髓前角神經(jīng)元自噬表達及機制研究
目的:
1、研究大鼠單側(cè)骶叢撕脫傷后患側(cè)脊髓前角神經(jīng)元的自噬表達規(guī)律及其與外源性HMGB1關系。2、研究外源性HMGB1誘導大鼠原代脊髓神經(jīng)元發(fā)生
9、自噬及機制。3、研究HMGB1誘導自噬在損傷環(huán)境下對大鼠原代脊髓神經(jīng)元的生物學意義。
方法:
1、選用成年雄性SD大鼠30只(體重200-220g),將其隨機分為5組,每組6只,首先建立單側(cè)腰4-腰6骶叢撕脫傷模型。分別于損傷后0小時,4小時,1天,3天,7天處死后取相應節(jié)段脊髓。分別觀察以下指標:①利用透射電鏡觀察脊髓前角自噬小體等結(jié)構。②利用免疫印跡法檢測自噬相關蛋白LC3-Ⅱ及p62的表達情況。③利用免疫熒光法
10、檢測自噬相關蛋白LC3-Ⅱ及神經(jīng)元特異性標記物NeuN的表達情況。再選用成年雄性SD大鼠10只(體重200-220g),將其隨機分為2組,每組5只。A組:撕脫+對照IgY抗體組,B組:撕脫+HMGB1中和抗體組。A組首先在腹腔內(nèi)注射對照IgY抗體(2μg/Kg),然后建立單側(cè)腰4-腰6骶叢撕脫傷模型,B組首先在腹腔內(nèi)注射HMGB1中和抗體(2μg/Kg),然后建立單側(cè)腰4-腰6骶叢撕脫傷模型,均于損傷后1天處死取相應節(jié)段脊髓。分別觀察以
11、下指標:①利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中HMGB1表達情況。②利用免疫熒光法檢測相應節(jié)段脊髓中HMGB1的表達情況。③透射電鏡觀察脊髓前角自噬小體等結(jié)構。④利用免疫印跡法檢測自噬相關蛋白LC3-Ⅱ及p62的表達情況。⑤利用免疫熒光法檢測自噬相關蛋白LC3-Ⅱ及神經(jīng)元特異性標記物NeuN的表達情況。
2、①取培養(yǎng)第7天的SD大鼠原代脊髓神經(jīng)元細胞,加入重組HMGB1(1μg/ml),分別于0小時、6小時、12小時、24小時、36小
12、時和48小時,利用免疫印跡法檢測自噬相關蛋白LC3-Ⅱ及p62的表達情況,利用細胞免疫熒光法檢測自噬相關蛋白LC3-Ⅱ表達情況。②取培養(yǎng)第7天的SD大鼠原代脊髓神經(jīng)元細胞,加入重組HMGB1(1μg/ml),分別于0小時、3小時、6小時、12小時、24小時,利用免疫印跡法檢測p-JNK,total-JNK,p-ERK,total-ERK,p-p38的表達情況。③取培養(yǎng)第7天的SD大鼠原代脊髓神經(jīng)元細胞首先分別加入SB(10μM)、SP(
13、20μM)和PD(20μM)處理1小時,然后加入重組HMGB1(1μg/ml)處理36小時,利用免疫印跡法檢測自噬相關蛋白LC3-Ⅱ表達情況。④取培養(yǎng)第7天的SD大鼠原代脊髓神經(jīng)元細胞,A組:對照組,B組:HMGB1干預組,C組:氧糖剝奪干預組(1小時或4小時),D組:HMGB1+氧糖剝奪干預組(1小時或4小時),E組:HMGB1+氧糖剝奪(1小時或4小時)+氯喹干預組。cck-8活力測定檢測神經(jīng)元存活率。
結(jié)果:
14、1、單側(cè)骶叢撕脫傷后患側(cè)脊髓前角電鏡下可見大量自噬小體,免疫印跡及免疫熒光檢測均可見自噬相關蛋白高表達,撕脫傷后4小時和1天強度最高。A組血清及脊髓中HMGB1表達水平顯著高于B組,電鏡觀察可見A組脊髓前角自噬小體數(shù)量大于B組,免疫印跡及免疫熒光檢測均可見A組自噬相關蛋白表達水平高于B組。
2、重組HMGB1顯著提高原代脊髓神經(jīng)元細胞的自噬相關蛋白表達,處理后36h表達最高。重組HMGB1激活原代脊髓神經(jīng)元細胞ERK、JNK和
15、p38 MAPK, ERK和JNK通路阻滯劑可降低自噬相關蛋白表達。HMGB1誘導的自噬在氧糖剝奪環(huán)境下提高細胞存活率,自噬阻滯劑氯喹預處理后顯著降低細胞存活率。
結(jié)論:
單側(cè)骶叢撕脫傷后患側(cè)脊髓前角神經(jīng)元發(fā)生自噬,撕脫傷后4小時和1天為表達最高。 HMGB1中和抗體可顯著降低骶叢撕脫傷后患側(cè)脊髓前角神經(jīng)元自噬表達。重組HMGB1可誘導原代脊髓神經(jīng)元細胞的自噬表達,并通過ERK和JNK通路參與自噬調(diào)控。 HMGB1誘
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