家蠶免疫穩(wěn)態(tài)調(diào)控分子BmFAF2的鑒定與功能研究.pdf

1、當(dāng)家蠶免疫系統(tǒng)受到免疫信號(hào)刺激后，通過(guò)激活Toll或Imd信號(hào)通路的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子Dorsal/Dif或Relish產(chǎn)生抗菌肽而發(fā)生免疫應(yīng)答。免疫刺激去除后，Toll或Imd信號(hào)通路的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子活性需要受到抑制，從而降低或阻止抗菌肽的產(chǎn)生來(lái)維持免疫穩(wěn)態(tài)和機(jī)體平衡。在果蠅中已報(bào)道多種降低或阻止免疫系統(tǒng)核轉(zhuǎn)錄因子活性或穩(wěn)定性的免疫穩(wěn)態(tài)調(diào)控分子，突變或敲除這些分子導(dǎo)致免疫系統(tǒng)過(guò)度激活。免疫穩(wěn)態(tài)調(diào)控的研究有助于更全面的了解免疫系統(tǒng)，而家蠶免

2、疫系統(tǒng)的研究尚未涉及免疫穩(wěn)態(tài)調(diào)控分子。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)生物信息學(xué)方法，在家蠶中鑒定了多個(gè)可能參與免疫穩(wěn)態(tài)調(diào)控的分子;通過(guò)病原微生物誘導(dǎo)感染家蠶后，研究這些分子在多種免疫器官中的誘導(dǎo)表達(dá)模式;通過(guò)在細(xì)胞水平上過(guò)表達(dá)或干涉BmFAF2，檢測(cè)經(jīng)免疫誘導(dǎo)后家蠶抗菌肽的表達(dá)量變化;并在個(gè)體水平上千涉BmFAF2后，檢測(cè)經(jīng)病原微生物感染后家蠶存活率的變化情況，以及檢測(cè)家蠶抗菌肽的表達(dá)量變化，從而研究BmFAF2調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)的機(jī)制;主要研究結(jié)果如下:

3、>　　 1、家蠶免疫穩(wěn)態(tài)調(diào)控分子的鑒定
　　 基于家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，我們初步篩選到了免疫穩(wěn)態(tài)分子BmWnt、BmUbc9、BmFAF2和BmPOSH等基因。家蠶中包含wnt結(jié)構(gòu)域的分子共9個(gè)，對(duì)應(yīng)的編號(hào)分別是BGIBMGA006145、BGIBMGA006146、BGIBMGA006147、BGIBMGA006148、BGIBMGA007580、BGIBMGA006004、BGIBMGA013783、BGIBMGA013787

4、和BGIBMGA013981;Ubc9所對(duì)應(yīng)的編號(hào)為BGIBMGA005425與BGIBMGA010222;FAF2所對(duì)應(yīng)的編號(hào)為BGIBMGA008874;POSH所對(duì)應(yīng)的編號(hào)為BGIBMGA012467。
　　 2、家蠶免疫穩(wěn)態(tài)分子的表達(dá)模式分析
　　 通過(guò)時(shí)期表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)BmWnt、BmUbc9、BmFAF2和BmPOSH在家蠶整個(gè)發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)。通過(guò)幾種病原微生物誘導(dǎo)家蠶后，我們研究了免疫穩(wěn)態(tài)分子BmWnt、

5、BmUbc9、BmFAF2和BmPOSH的表達(dá)模式。研究發(fā)現(xiàn)不同基因在同一組織或同一基因在不同組織的表達(dá)模式有所差異，但總體規(guī)律表現(xiàn)為:在受病原微生物感染初期的6-12h這些基因的表達(dá)量保持在較低的水平，在感染的中后期這些基因的表達(dá)量表現(xiàn)為短暫迅速上升，然后表達(dá)量迅速下降到正常水平或正常水平以下。
　　 3、BmFAF2的功能研究
　　 我們構(gòu)建了BmFAF2基因的真核表達(dá)載體并合成了該基因的干涉dsRNA。通過(guò)將BmF

6、AF2基因的真核表達(dá)載體和干涉dsRNA轉(zhuǎn)染BmE細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，當(dāng)家蠶BmE細(xì)胞受脂多糖(LPS)誘導(dǎo)后，過(guò)表達(dá)BmFAF2會(huì)阻礙BmAttacinA、BmMoricinA和BmcecropinA三種抗菌肽的表達(dá)，干涉BmFAF2后會(huì)促進(jìn)BmAttacinA和BmMoricinA的表達(dá)。存活率試驗(yàn)結(jié)果顯示，BmFAF2基因干涉組經(jīng)病原微生物誘導(dǎo)后的存活率明顯大于對(duì)照組，對(duì)照組中注射ddH2O和dsRed的實(shí)驗(yàn)組存活率大致相同。并且在干涉Bm