IL-17與LPS協(xié)同介導(dǎo)炎性腸病的效應(yīng)機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　 Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-17在自身免疫性炎性腸病的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但其具體的效應(yīng)機(jī)制尚不十分清楚。在炎癥環(huán)境中，IL-17介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)常與其它炎癥介質(zhì)（如細(xì)菌脂多糖，LPS）引發(fā)的反應(yīng)伴隨存在，因此有必要探討IL-17與其它炎癥介質(zhì)聯(lián)合作用。IL-17的效應(yīng)機(jī)制如何，通過(guò)什么樣的機(jī)制與其它的炎癥介質(zhì)發(fā)揮聯(lián)合作用是目前尚不清楚的課題?；谏鲜霰尘?，我們首先探討IL-17細(xì)胞因子在TNBS誘導(dǎo)的炎性腸病

2、動(dòng)物模型中的表達(dá)變化;其次以HT-29結(jié)腸癌上皮細(xì)胞系為模型，研究IL-17與脂多糖(LPS)在結(jié)腸上皮細(xì)胞中的效應(yīng)機(jī)制，為以IL-17為靶點(diǎn)的炎性腸病干預(yù)策略提供新的理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 第一:探討IL-17/IL-17R在炎性腸病中的表達(dá)變化。通過(guò)建立TNBS炎性腸病模型，采用嗜熱菌蛋白酶分離法，進(jìn)行小鼠結(jié)直腸上皮細(xì)胞的分離，提取腸上皮細(xì)胞總RNA，通過(guò)Real-time PCR方法檢測(cè)IL-17及其

3、受體在TNBS炎性腸病模型中的表達(dá)變化;
　　 第二:以人腸上皮細(xì)胞---HT-29細(xì)胞為模型，觀察IL-17與細(xì)菌脂多糖LPS協(xié)同促進(jìn)腸上皮細(xì)胞活化，介導(dǎo)免疫損傷的分子機(jī)制。
　　 首先通過(guò)流式細(xì)胞儀分離技術(shù)(FACS)檢測(cè)IL-17RA、TLR-4在HT-29細(xì)胞中的表達(dá)，在此基礎(chǔ)上觀察IL-17和不同劑量LPS干預(yù)人腸上皮細(xì)胞（HT-29細(xì)胞）;以及為探討IL-17與不同濃度LPS共同在HT-29細(xì)胞中的效應(yīng)，通過(guò)

4、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法，檢測(cè)細(xì)胞因子IL-8的表達(dá);其次為探討IL-17協(xié)同LPS促進(jìn)HT-29細(xì)胞活化的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，我們通過(guò)Western Blot技術(shù)，觀察IL-17與LPS聯(lián)合干預(yù)人腸上皮細(xì)胞(HT-29細(xì)胞)后細(xì)胞內(nèi)PI3K-AKT、NF-κ B、MAPK通路的活化情況;再次在IL-17協(xié)同LPS通過(guò)PI3K-AKT、NF-κ B、MAPK通路促進(jìn)HT-29細(xì)胞活化基礎(chǔ)上，為探討在自身免疫性炎性腸病發(fā)病過(guò)程中多種因子共

5、同作用、相互影響體內(nèi)微環(huán)境情況下細(xì)胞因子及趨化因子可能的效應(yīng).我們通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，利用Real-time PCR方法來(lái)觀察hIL-17和LPS聯(lián)合作用于HT-29細(xì)胞情況下中性粒細(xì)胞、Th17細(xì)胞、Th1細(xì)胞等趨化因子的變化;最后為進(jìn)一步明確介導(dǎo)hIL-17和LPS在基因水平效應(yīng)的具體細(xì)胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制，我們通過(guò)給予各信號(hào)通路抑制劑干預(yù)情況下，利用Real-time PCR方法觀察hIL-17和LPS聯(lián)合作用于HT-29細(xì)胞后趨化因子的變化。

6、
　　 結(jié)果:
　　 第一:IL-17以及IL-17RAmRNA在TNBS誘導(dǎo)的炎性腸病動(dòng)物模型中表達(dá)顯著升高(P＜0.03);
　　 第二:在以HT-29結(jié)腸上皮細(xì)胞模型中，首先我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HT-29細(xì)胞高表達(dá)IL-17RA，以及TLR4分子，在此基礎(chǔ)上我們發(fā)現(xiàn)靜息狀態(tài)下HT-29細(xì)胞表達(dá)IL-8的水平低，LPS刺激(10 ng/mL)6h后腸上皮細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)IL-8，第12 h時(shí)IL-8的表達(dá)顯著增加(與第6

7、h時(shí)相比，P＜0.01)，第24h達(dá)高峰(與第12 h時(shí)相比，P＜0.01)，而IL-17單獨(dú)作用于HT-29細(xì)胞表達(dá)IL-8的水平低;其次我們研究發(fā)現(xiàn)IL-17能與低濃度的LPS協(xié)同促進(jìn)IL-8的表達(dá)(2187.61±132.42 vs2634.27±134.63，P=0.01)，但隨著LPS劑量升高，LPS本身誘導(dǎo)IL-8表達(dá)的活性降低，且與IL-17的協(xié)同作用消失(1841.43±50.38 vs1685.67±71.47，P=0

8、.01);研究IL-17與低濃度LPS聯(lián)合作用的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)是通過(guò)增強(qiáng)NF-κ B、PI3K-AKT、MAPK信號(hào)通路的活化，促進(jìn)炎癥反應(yīng).再次，我們研究IL-17和LPS作用于HT-29細(xì)胞情況下趨化因子的變化，發(fā)現(xiàn)IL-17單獨(dú)效應(yīng)弱，兩者協(xié)同促進(jìn)中性粒相關(guān)趨化因子(包括CXCL-1、CXCL-2，CXCL-5，CXCL-6，CXCL-8)和Th17細(xì)胞趨化因子CCL-20mRNA的表達(dá);最后我們探討介導(dǎo)其趨化因子變化的具體

9、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)中性粒相關(guān)趨化因子表達(dá)是通過(guò)NF-κ B、PI3k、MAPK途徑介導(dǎo)的，只是不同通路作用的程度不同;對(duì)于Th17細(xì)胞趨化因子的表達(dá)是通過(guò)NF-κB、MAPK途徑介導(dǎo)活化的，而PI3k通路介導(dǎo)抑制;IL-17拮抗LPS誘導(dǎo)的Th1細(xì)胞因子的表達(dá)，是由PI3k、ERK介導(dǎo)的，而NF-κ B、P38起相反作用。
　　 結(jié)論:
　　 ①I(mǎi)L-17參與炎性腸病的免疫損傷過(guò)程。
　　 ②IL-17與低濃度